이 프로토콜은 현재 미생물 물질과 환경 알레르겐이 알레르기 염증의 발달을 조절할 수있는 방법에 대한 매우 중요하고 해결되지 않은 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다. 구체적으로, 여기에 제시된 방법은 집 먼지 진드기에 있는 이중 좌초 RNA 종이 생체내 면역원성이고 호산성 폐 염증을 조절할 수 있는지 여부를 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 간단하고 효율적이며 재현성이 뛰어나며 일반적으로 사용되는 도구와 장비를 사용하여 수행할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 또한 호흡기 바이러스성 감염에 기인한 폐 질병을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 내 실험실에서 대학원생 인 Li She는 절차를 시연하는 데 도움이 될 것입니다. 알레르겐, 곤충 및 비 곤충 알레르겐에서 총 RNA를 격리하는 것으로 시작합니다.
적당한 양의 시편을 1.4밀리미터의 세라믹 구슬을 함유한 2밀리리터 튜브로 옮기고, 액체 질소 용기에 튜브를 약 10분 동안 동결한다. 각 튜브에 구안디늄 티오야네이트 계 RNA 격리 시약 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 곤충과 곤충이 아닌 작은 동물을 고에너지 세포 파괴기로 45초 동안 최대 속도로 분해합니다.
얼음에 샘플을 냉각하고 두 번이 과정을 반복합니다. 솔루션을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 각 튜브에 200 마이크로리터를 추가하고 샘플을 소용돌이시다.
14, 000배의 튜브를 섭씨 4도에서 14분간 원심분리합니다. 그런 다음 상부 수성 상을 500 마이크로리터의 이소프로판올을 포함하는 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 샘플을 섞는다.
그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 14 분 동안 14, 000 배 g에서 원심 분리합니다. 신중하게 슈퍼 나티를 흡인. 그런 다음 RNA 펠릿을 75%에탄올의 500 마이크로리터로 세척하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 7, 500회 g에서 씻어낸다.
조심스럽게 모든 액체를 제거합니다. 펠릿을 공기 건조시키고 RNA가 없는 물 20~50마이크로리터로 RNA를 용해시키십시오. 총 RNA에서 이중 좌초 된 RNA 구조를 검출하기 위해, 양전하 나일론 멤브레인에 마이크로리터 당 200 나노 그램 RNA 샘플의 2 개의 마이크로 리터를 발견한다.
UV 크로스링커에서 1, 200 마이크로줄에서 멤브레인에 샘플을 교차 연결합니다. 얼룩당 총 1.2 마이크로그램의 RNA가 생성되는 두 번 더 스포팅및 교차 연결을 반복합니다. 실온에서 흔들면서 1시간 동안 TBS-T에서 5%의 우유로 비특이적 결합을 차단합니다.
그런 다음 차단 용액을 제거하고 TBS-T에서 1%의 우유에 1대 1, 000 희석에서 반이중 좌초 RNA J2 항체를 첨가한다. 하룻밤 사이에 막을 배양하고 섭씨 4도에서 흔들어 보임. 다음 날, 세척 당 5 분 동안 TBS-T로 멤브레인을 세 번 씻으시다.
이차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 배양하십시오. 그런 다음 TBS-T로 세서를 반복합니다. 기판을 추가하고 원하는 신호가 보일 때까지 멤브레인을 5~15분 동안 배양합니다.
이중 증류수로 멤브레인을 헹구어 반응을 멈춥시다. 폐 샘플을 수집하려면 폐를 조직 용지에 놓고 각 폐 엽의 작은 조각을 소비합니다. 각 조각을 구슬이 들어 있는 2밀리리터 튜브에 넣습니다.
기관지 알롤라 라베이를 수집하려면 안락사 마우스를 70 %에탄올로 소독하고 가위를 사용하여 복부의 상부 영역에서 목으로 피부를 자른다. 침샘과 스테르노하이드 근육을 집게로 떼어 내어 기관지를 노출시합니다. 그런 다음 나일론 문자열을 아래에 놓습니다.
캐뉼라를 삽입하기에 충분한 후두 아래 약 2 밀리리터의 기관장에 절개를 하고 기관지와 캐뉼라 주위에 끈을 매듭짓십시오. 주사기를 캐뉼라 끝에 부착하고 신선한 PBS-EDTA로 로드합니다. 그런 다음 용액의 1 밀리리터를 주입하고 폐에 흡입합니다.
주사기를 캐뉼라에서 분리하고 용액을 15 밀리리터 튜브로 배출합니다. 이 과정을 반복하여 신선한 PBS-EDTA로 얼음을 만들고 라베를 풀수 있습니다. 4섭씨에서 7분간 500g의 원심분리기.
그런 다음 볼륨을 기록하고 펠릿을 방해하지 않고 두 개의 1.5 밀리리터 튜브로 상수튜브를 전송합니다. 펠릿을 다시 중단한 후 150마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮기고, 접시를 500배, 섭씨 4도에서 7분간 원심분리합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼의 접시를 재빨리 반전하여 상체를 제거합니다.
2.4G2 차단 항체의 존재에 FACS 버퍼에 항체를 가진 세포를 얼룩시키고, 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양한다. 염색 후, 원심분리판을 500배 g로 4°C에서 7분간 펠릿하게 한다. 티슈 페이퍼의 플레이트를 반전시켜 염색 용액을 제거합니다.
FACS 버퍼 100마이크로리터를 추가하여 세포를 세척한 다음 원심 분리를 반복합니다. 150마이크로리터의 FACS 버퍼에서 샘플을 다시 중단한 다음 추가 350마이크로리터의 완충제가 포함된 FACS 튜브로 전송합니다. 각 샘플에 구슬 을 계산하는 25 마이크로 리터를 추가하고 유동 세포 분석으로 진행합니다.
집 먼지 진드기, 곤충 및 비 곤충 작은 동물에 긴 이중 좌초 RNA 구조의 존재는 이중 좌초, RNA 특정 마우스 단일 클론 항체를 사용하여 점 블롯에 의해 검사되었다. RNase III는 J2에 의해 검출할 수 없는 12 15개의 염기 쌍 단편으로 이중 좌초 RNA를 소화하기 위하여 이용되었습니다. 마우스 폐에서 선천적인 면역 반응을 자극하는 집 먼지 진드기 총 RNA의 능력은 RT-qPCR에 의해 입증되었다. RNase III 치료는 집 먼지 진드기 총 RNA의 면역 자극 활성을 폐지, 이중 좌초 RNA 구조는 폐에서 타고난 면역 활동에 필수적임을 나타내는.
중증형 2형 폐염증의 개발에 대한 집먼지 진드기 총 RNA의 억제 효과는 FACS 분석을 통해 평가하였다. 호산성 폐 염증은 RNase III의 유무에 관계없이 치료된 먼지 진드기 추출물에 의해 유도되었다. 긴 이중 좌초 RNA 종의 분해는 기관지 정맥포 라베이지 및 폐에서 증가 호산구 수에 의해 반영 된 심한 유형 2 폐 염증을 초래했다.
특히, 먼지 진드기 총 RNA 처리 군에서 호산구의 수는 내인적으로 긴 이중 좌초 RNA 종을 포함하는 원래의 먼지 진드기 추출물로 처리된 그룹과 비교된다. 이 프로토콜을 시도할 때, 이 단계에서 폐에 어떤 손상이 최종 결과를 바꿀 수 있기 때문에 BAL 액체를 주입하고 회수할 때 매우 주의하십시오. 이 절차 이외에, ELISA와 같은 다른 방법은 BAL 유체에 존재하는 비세포 수용성 함량을 분석하기 위해 수행될 수 있다.
개발 후, 이 기술은 알레르기 성 폐 염증의 발달을 조절할 수 있는 비 이중 좌초 RNA 요인과 같은 환경 알레르겐에 존재하는 그밖 미생물 물질을 탐구하는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
