Este protocolo fue diseñado para abordar un problema muy importante y sin resolver sobre cómo las sustancias microbianas presentes y los alérgenos ambientales pueden regular el desarrollo de la inflamación alérgica. Específicamente, los métodos presentados aquí pueden ayudar a responder si las especies de ARN de doble cadena en los ácaros del polvo de la casa son inmunogénicas in vivo y capaces de modular la inflamación pulmonar eosinofílica. Las principales ventajas de estas técnicas son que son simples, eficientes, altamente reproducibles y se pueden realizar utilizando herramientas y equipos de uso común.
Estos métodos también se pueden utilizar para evaluar enfermedades pulmonares causadas por infecciones virales respiratorias. Li She, una estudiante de posgrado en mi laboratorio, ayudará a demostrar el procedimiento. Comience por aislar el ARN total de alérgenos, insectos y alérgenos no insectos.
Transfiera una cantidad adecuada de muestra a un tubo de dos mililitros que contenga 1,4 milímetros de perlas de cerámica, y congele los tubos en un recipiente de nitrógeno líquido durante aproximadamente 10 minutos. Añadir un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN basado en tiocianato de guanidinio a cada tubo. Luego rompe el insecto y los animales pequeños que no son insectos con un disruptor celular de alta energía a la velocidad máxima durante 45 segundos.
Enfríe la muestra sobre hielo y repita este proceso dos veces. Transfiera la solución a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 200 microlitros de cloroformo a cada tubo, y vórtice la muestra.
Centrifugar los tubos a 14.000 veces g durante 14 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo que contenga 500 microlitros de isopropanol. Mezcle la muestra.
Luego centríféctelo a 14.000 veces g durante 14 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, lave el pellet de ARN con 500 microlitros de 75% etanol, y centrifugarlo a 7.500 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Retire con cuidado todo el líquido. Seque al aire el pellet y disuelva el ARN con 20 a 50 microlitros de agua libre de RNase. Para detectar las estructuras de ARN de doble cadena en el ARN total, detecte dos microlitros de la muestra de ARN de 200 nanogratros por microlitro en la membrana de nylon cargada positivamente.
Entrecruza las muestras a la membrana a 1.200 microjulios por 100 en un reticulante UV. Repita el detección y la reticulación dos veces más, lo que resultará en un total de 1,2 microgramos de ARN por mancha. Bloquee la unión no específica con 5% de leche en TBS-T durante una hora mientras agita a temperatura ambiente.
A continuación, retire la solución de bloqueo y añada el anticuerpo anti-doble cadena de ARN J2 a una dilución de uno a 1.000 en 1% de leche en TBS-T. Incubar la membrana durante la noche con temblores a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave la membrana tres veces con TBS-T durante cinco minutos por lavado.
Agregue el anticuerpo secundario e incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, repita los lavados con TBS-T. Agregue el sustrato e incubar la membrana durante cinco a 15 minutos hasta que la señal deseada sea visible.
Detenga la reacción enjuagando la membrana con agua de doble destilación. Para recoger las muestras de pulmón, coloque los pulmones en papeles tisú e insúselo un pequeño pedazo de cada lóbulo pulmonar. Coloque cada pieza en un tubo de dos mililitros que contenga perlas.
Para recoger el lavado broncoalveolar, desinfectar un ratón eutanizado con 70%etanol, y utilizar tijeras para cortar la piel desde la zona superior del abdomen hasta el cuello. Tire suavemente de las glándulas salivales y el músculo esternohoides con fórceps para exponer la tráquea. A continuación, coloque una cuerda de nylon debajo de ella.
Haga una incisión en la tráquea aproximadamente dos mililitros debajo de la laringe lo suficiente como para insertar una cánula, y anuda la cuerda alrededor de la tráquea y la cánula. Coloque una jeringa en el extremo de la cánula y cárguelo con PBS-EDTA fresco. A continuación, inyecte y aspire un mililitro de la solución en el pulmón.
Separe la jeringa de la cánula y expulse la solución en un tubo de 15 mililitros. Repita este proceso al hielo con PBS-EDTA fresco y a la piscina el lavado. Centrifugar el tubo a 500 veces g durante siete minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, registre el volumen y transfiera el sobrenadante a dos tubos de 1,5 mililitros sin alterar el pellet. Después de resuspender el pellet, transfiera 150 microlitros a una placa de 96 pozos, y centrifuga la placa durante siete minutos a 500 veces g y cuatro grados Celsius. A continuación, invierta rápidamente la placa en papel tisú para extraer el sobrenadante.
Manchar las células con anticuerpos en el tampón FACS en presencia de 2.4G2 anticuerpos de bloqueo, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la tinción, centrifugar la placa para peletizar las células a 500 veces g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Retire la solución de tinción invirtiendo la placa en papel tisú.
Agregue 100 microlitros de tampón FACS para lavar las células y luego repita la centrifugación. Resuspender las muestras en 150 microlitros de tampón FACS, y luego transferirlas a tubos FACS que contengan 350 microlitros adicionales de tampón. Agregue 25 microlitros de cuenta de cuentas a cada muestra y proceda con el análisis de citometría de flujo.
La presencia de estructuras de ARN de doble cadena larga en ácaros del polvo de la casa, insectos y animales pequeños no insectos fue examinada por la mancha de puntos utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón de doble cadena, específico del ARN. RNase III se utilizó para digerir el ARN de doble cadena en 12 a 15 fragmentos de par base, que eran indetectables por J2. LA capacidad del ARN total de ácaros del polvo de la casa para estimular una respuesta inmune innata en los pulmones del ratón fue demostrada por RT-qPCR. El tratamiento RNase III abolió la actividad inmunoestimulante del ARN total de ácaros del polvo de la casa, lo que indica que las estructuras de ARN de doble cadena son esenciales para la actividad inmune innata en los pulmones.
El efecto inhibitorio del ARN total de ácaros del polvo de la casa en el desarrollo de una inflamación pulmonar de tipo dos grave se evaluó con el análisis FACS. La inflamación pulmonar eosinofílica fue inducida por extractos de ácaros del polvo, que fueron tratados con o sin RNase III. La degradación de las especies de ARN de doble cadena de largo flujo dio lugar a una inflamación pulmonar de tipo dos grave, reflejada por el aumento del número de eosinófilos en el lavado broncoalveolar y los pulmones.
En particular, el número de eosinófilos en el grupo total tratado con ARN de ácaros del polvo es comparable al grupo tratado con el extracto de ácaro de polvo original que contenía endógenamente la especie de ARN de doble cadena larga. Al intentar este protocolo, tenga mucho cuidado al inyectar y recordar el líquido BAL, ya que cualquier daño a los pulmones en esta etapa puede alterar los resultados finales. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA para analizar el contenido no celular soluble presente en el fluido BAL.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran otras sustancias microbianas presentes en los alérgenos ambientales, como los factores de ARN no de doble cadena que pueden regular el desarrollo de inflamación pulmonar alérgica.
