Questo protocollo è stato progettato per affrontare un problema molto importante e irrisolto su come le sostanze microbiche presenti e gli allergeni ambientali possono regolare lo sviluppo di infiammazioni allergiche. In particolare, i metodi qui presentati possono aiutare a rispondere se le specie di RNA a doppio filamento negli acari della polvere domestica sono immunogeniche in vivo e in grado di modulare l'infiammazione polmonare eosinofila. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono semplici, efficienti, altamente riproducibili e possono essere eseguite utilizzando strumenti e attrezzature di uso comune.
Questi metodi possono anche essere utilizzati per valutare le malattie polmonari causate da infezioni virali respiratorie. Li She, una studentessa laureata nel mio laboratorio, aiuterà a dimostrare la procedura. Inizia isolando l'RNA totale da allergeni, insetti e allergeni non insetti.
Trasferire una quantità adeguata di campione in un tubo da due millilitri contenente 1,4 millimetri di perline di ceramica e congelare i tubi in un contenitore di azoto liquido per circa 10 minuti. Aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA a base di tiocianato di guanidinio ad ogni tubo. Quindi rompere l'insetto e i piccoli animali non insetti con un disgregatore cellulare ad alta energia alla massima velocità per 45 secondi.
Raffreddare il campione sul ghiaccio e ripetere questo processo due volte. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascun tubo e vortice il campione.
Centrifuga i tubi a 14.000 volte g per 14 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo contenente 500 microlitri di isopropanolo. Mescolare il campione.
Quindi centrifugarlo a 14.000 volte g per 14 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare con cura il supernatante. Quindi lavare il pellet di RNA con 500 microlitri di etanolo al 75% e centrifugarlo a 7.500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere con cura tutto il liquido. Asciugare all'aria il pellet e sciogliere l'RNA con da 20 a 50 microlitri di acqua priva di RNasi. Per rilevare le strutture dell'RNA a doppio filamento nell'RNA totale, individuare due microlitri del campione di RNA da 200 nanogrammi per microlitro sulla membrana di nylon caricata positivamente.
Collegare i campioni alla membrana a 1.200 microjoule per 100 in un reticolatore UV. Ripetere l'avvistamento e il reticolo altre due volte, il che si tradurrà in un totale di 1,2 microgrammi di RNA per macchia. Blocca l'attacco non specifico con il 5% di latte in TBS-T per un'ora mentre tremi a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere l'anticorpo RNA J2 anti-doppio filamento a una diluizione uno-a-1.000 nel latte all'1% in TBS-T. Incubare la membrana durante la notte con tremori a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con TBS-T per cinque minuti per lavaggio.
Aggiungere l'anticorpo secondario e incubare la membrana per un'ora a temperatura ambiente. Quindi ripetere i lavaggi con TBS-T. Aggiungere il substrato e incubare la membrana per cinque-15 minuti fino a quando non è visibile un segnale desiderato.
Interrompere la reazione risciacquando la membrana con acqua doppia distillata. Per raccogliere i campioni polmonari, posizionare i polmoni su carte velina e asportare un piccolo pezzo di ogni lobo polmonare. Posizionare ogni pezzo in un tubo da due millilitri contenente perline.
Per raccogliere la lavanda broncoalveolare, disinfettare un topo eutanasiato con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per tagliare la pelle dalla zona superiore dell'addome al collo. Estrarre delicatamente le ghiandole salivari e il muscolo sternoioide con le flessorie per esporre la trachea. Quindi posizionare una corda di nylon sotto di essa.
Fare un'incisione nella trachea circa due millilitri sotto la laringe quanto basta per inserire una cannula e annodare la corda intorno alla trachea e alla cannula. Attaccare una siringa all'estremità della cannula e caricarla con PBS-EDTA fresco. Quindi iniettare e aspirare un millilitro della soluzione nel polmone.
Staccare la siringa dalla cannula ed espellere la soluzione in un tubo da 15 millilitri. Ripetere questo processo sul ghiaccio con PBS-EDTA fresco e mettere in comune la lavanda. Centrifugare il tubo a 500 volte g per sette minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi registrare il volume e trasferire il supernatante in due tubi da 1,5 millilitri senza disturbare il pellet. Dopo aver riaspenso il pellet, trasferire 150 microlitri in una piastra da 96 po 'e centrifugare la piastra per sette minuti a 500 volte g e quattro gradi Celsius. Quindi invertire rapidamente la piastra sulla carta velina per rimuovere il supernatante.
Macchiare le cellule con anticorpi nel tampone FACS in presenza di anticorpi bloccanti 2.4G2 e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Dopo la colorazione, centrifugare la piastra per pellettare le cellule a 500 volte g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione di colorazione invertendo la piastra su carta velina.
Aggiungere 100 microlitri di tampone FACS per lavare le cellule, quindi ripetere la centrifugazione. Riaspensare i campioni in 150 microlitri di tampone FACS, quindi trasferirli in tubi FACS contenenti altri 350 microlitri di tampone. Aggiungere 25 microlitri di perline di conteggio a ciascun campione e procedere con l'analisi della citometria del flusso.
La presenza di lunghe strutture a RNA a doppio filamento negli acari della polvere domestica, negli insetti e nei piccoli animali non insetti è stata esaminata da una macchia a punti usando un anticorpo monoclonale del topo a doppio filamento specifico dell'RNA. La RNasi III è stata usata per digerire l'RNA a doppio filamento in frammenti di coppia di basi da 12 a 15, che non erano rilevabili da J2. La capacità dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica di stimolare una risposta immunitaria innata nei polmoni del topo è stata dimostrata da RT-qPCR. Il trattamento RNasi III ha abolito l'attività immunostimolante dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica, indicando che le strutture dell'RNA a doppio filamento sono essenziali per l'attività immunitaria innata nei polmoni.
L'effetto inibitorio dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica sullo sviluppo di una grave infiammazione polmonare di tipo due è stato valutato con l'analisi FACS. L'infiammazione polmonare eosinofila è stata indotta da estratti di acari della polvere, che sono stati trattati con o senza RNasi III. La degradazione delle lunghe specie di RNA a doppio filamento ha provocato una grave infiammazione polmonare di tipo due, riflessa dall'aumento del numero di eosinofili nel lavaggio broncoalveolare e nei polmoni.
In particolare, il numero di eosinofili nel gruppo totale trattato con RNA dell'acaro della polvere è paragonabile al gruppo trattato con l'estratto originale di acaro della polvere che conteneva endogenamente le lunghe specie di RNA a doppio filamento. Quando si tenta questo protocollo, fare molta attenzione quando si inietta e si ricorda il liquido BAL, poiché qualsiasi danno ai polmoni in questa fase può alterare i risultati finali. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ELISA per analizzare i contenuti solubili non cellulari presenti nel fluido BAL.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare altre sostanze microbiche presenti negli allergeni ambientali, come fattori di RNA non a doppio filamento che possono regolare lo sviluppo di infiammazione polmonare allergica.
