该协议有助于研究具有不同寡聚状态和寡聚相关活性的氨基肽，这些活性酶在非活性二聚剂和活性多德卡默斯之间保持平衡。这种传统技术可以轻松地在任何实验室中执行。除了要求访问光束线或X射线晶体学设施外，不需要特殊设备。
对于某种适应，此方法可应用于任何其他具有活动或功能的蛋白质，其活性或功能取决于其寡聚化程度。要处理 X 射线数据，用户必须对晶体学有最低限度的了解。我们邀请用户关注培训，访问XXS Wiki，并观看Phenix教程。
要执行活动测定， 在 75 摄氏度干浴中加入 25 微升 100 mM L-Leucine p-硝基苯甲酰胺至 965 微升 50 毫摩尔莫普、250 微摩尔钴二氯化物和 10% 甲醇预孵化反应混合物，然后稀释至 1 微摩尔最终浓度，再增加 50 毫摩尔 MM。接下来，在反应混合物中加入10微升微摩尔酶，然后旋转产生的溶液，然后将反应返回75摄氏度的干浴，不超过一小时。当溶液变黄时，停止与20%酸的一毫升反应，并旋转混合物，然后使其冷却至室温。
然后将反应混合物的等分数转移到分光光度计细胞，并读取410纳米的吸收剂，以对抗没有酶的孵育反应混合物，作为负对照。对于苯丙胺制备，在 890 微升 50 毫摩尔莫普、0.5 摩尔硫酸铵和 100 微升纯化 TmPep1050 中加入 10 微升 1，10-phenanthroline 库存溶液。使用活性测定检查活性损失，如证明没有添加钴二氯化物。
检测后，将样品转移到透析管中，在4摄氏度下对200毫升50毫摩尔莫普和0.5摩尔硫酸铵进行透析。在48小时透析期间，用新鲜缓冲液更换三次透析液，从透析管中采集样品。使用具有 30 千吨截止的超滤单元，将样品浓缩回 100 微升，并在 280 纳米的纳米体积分光光度计上检查浓度。
准备调粉稀释酸酶，在50毫摩尔莫巴斯和0.5摩尔硫酸铵中稀释一微摩尔浓度，并在75摄氏度的干浴中孵育反应两小时。然后将酶样品浓缩到至少50微升浓度时，通过大小排除色谱检查分子量。为了改善蛋白质晶体的形状、大小和结晶度，在一滴晶体中加入适当体积的优化结晶溶液，使晶体液滴体积达到10微升。
将液滴转移到1.5毫升微管中，并在播种良好的种子中再加入90微升结晶溶液。对于每颗种子稀释，在每口井中加入500微升结晶试剂，并在结晶板中加入适当数量的井中，并将两个微升蛋白质样品与两个结晶试剂微升和0.2微升种子混合在每口一个结晶支持中。然后将支架固定到结晶试剂的每个井上。
对于晶体采摘，在浴缸中加满液氮，将用于样品处理的任何小瓶或篮子放入氮气中。处理液氮是危险的，它可能会导致严重的冻伤。一定要穿适当的个人防护，如低温手套和护目镜。
根据晶体大小设置不同尺寸的样品拾取循环，并使用双筒望远镜选择含有晶体的滴。然后使用循环从一个井中轻轻地选择一个隔离的晶体，并立即将循环放入液氮中，然后再将循环放入合适的小瓶中。要测量衍射点强度，请创建一个文件夹，从该文件夹运行 XDS 并找到图像的路径。
若要运行 xdsme，请在终端窗口中输入命令。XDS 结束后，作业检查正确的 lp 文件，并记下空间组确定、数据完整性、最高分辨率、水晶镶嵌度和数据质量的概率。在检查 XDS 无意义日志以获取空间组的可能性后，使用命令在单独的文件夹中使用 XDS 建议的不同空间组解决方案重新运行 xdsme，以避免覆盖上一个进程。
根据数据统计信息选择最佳解决方案后，输入运行 XSCALE 和 XDSCONV 的命令。要确定没有异常散射项的相位，请使用 4P X，Y 坐标，为分子替换准备起始模型。从PDB文件，使用Phenix PDB文件编辑器提取单体和截断其氨基酸在丙氨酸。
运行 X 与 XDSCONV 生成的反射文件和作为输入序列进行分诊。检查 Xtriage 的日志文件。注意完整性、非对称单元中的亚单位数量、各向异性、冰环的存在和结对发生。
要运行Phenix中的相位-MR进行分子替换，请选择反射文件、序列和起始的4P 6 Y模型，在聚氨酯中截断，然后单击"运行"。完成后，检查是否找到模型，并检查分子替换的分数。翻译因子 Z 分数至少为 8，表示解决方案明确正确。
通过分子替换确定相位后，选择"运行自动生成"并单击"运行"。将自动添加所有必需的文件。完成后，根据COOT中的电子密度图，检查COOT中的模型，并手动构建和优化模型。
使用此模型、序列和衍射数据作为输入，在 Phenix 中优化手动策划的模型，参考 Phenix 来帮助选择正确的策略。细化后检查结果，细化免费和细化工作必须减少。必须尊重摩尔质量指标，必须限制实际空间相关性较低的离群值。
生成最佳优化模型后，在服务器上运行 MolProbity 并检查程序标识的任何异常值。大小排除色谱可用于确定纯化蛋白质的表观分子量。肽的结晶条件，可以通过改变pH值与PEG浓度围绕二丁石的条件进行优化。
例如，最好的TmPep1050 H60A H307A晶体，是在0.1摩尔柠檬酸钠中获得的，pH为5.2和20%PEG 3350浓度，经过一个周期的微播种，以提高微结晶度。在此分析中，数据索引显示，TmPep1050 H60A H307A晶体的空间组为C2221，但XDS提出了另一种解决方案，即MP空间组。TmPep1050 H60A H307A 的结构，经过几个周期的自动化和手动优化后可以完成。
确认寡聚状态，单体之间的界面表面为1，710平方，界面形成的自由能量为每摩尔负16.2千卡。在这里，可以观察到 TmPep1050 H60A H307A 活动站点与 TmPep1050 二元和多德卡默的活动位点相比的特写。构建模型时，请注意只构建电子密度中看到的数据，以避免过度解释、数据，并花时间对模型进行润色。
二丁和多德卡默的分子量也可以由本地质谱仪确定。这些方法可用于检测过渡寡聚物。
