이 프로토콜은 비활성 디머와 활성 도데카메르 사이의 균형을 이루는 다른 올리고머화 의존적 활동과 아미노펩티다제의 연구를 용이하게 한다. 이 기존의 기술은 모든 실험실에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 빔라인 또는 엑스레이 결정화 시설에 대한 접근이 필요한 것 외에도 특수 장치가 필요하지 않습니다.
일부 적응을 통해, 이 방법은 올리고머화의 정도에 의존하는 활동 또는 기능을 가진 다른 단백질에 적용될 수 있다. 엑스레이 데이터를 처리하려면 사용자는 결정예 학적에 대한 최소한의 이해가 있어야합니다. 우리는 교육을 따르고 XDS 위키를 방문하고 Phenix 자습서를 시청하도록 사용자를 초대합니다.
활동 분석기를 수행하려면 100mM L-류신 p-니트로아닐드 25마이크로리터를 50밀리알러 MOPS965마이크로리터, 250 마이크로몰라 코발트 2염화 2개, 메탄올 Pre를 75도 의 건조 목욕으로 배양한 후, 효소를 1mmmops로 희석하기 전에 50밀리아플루에틸라를 첨가한다. 다음으로, 반응 혼합물에 10개의 마이크로리터를 추가하고 1시간 이상 섭씨 75도 건조 목욕에 반응을 되돌리기 전에 생성된 용액을 소용돌이시다. 용액이 노랗게 변하면 20%의 산산으로 반응을 멈추고 혼합물을 소용돌이로 처리한 후 실온으로 냉각하십시오.
그런 다음 반응 믹스의 알리쿼트를 분광광계 세포로 옮기고 410 나노미터에서 흡수체를 효소 없이 배양된 반응 믹스에 대하여 부정적인 대조군으로 읽습니다. 아포엔자임 제제를 위해, 50 밀리머 걸레 MOPS 의 890 마이크로리터, 0.5 어어 암모늄 황산염 및 정제 된 TmPep1050의 100 마이크로 리터에 1, 10 페난트로인 스톡 솔루션10 마이크로 리터를 추가합니다. 코발트 2염화물을 첨가하지 않고 입증된 바와 같이 활성 분석체를 사용하여 활동 손실을 확인한다.
분석 후, 투석 튜브로 샘플을 전송하고 섭씨 4도에서 50 밀리리터 의 200 밀리리터와 0.5 해저 황산염에 대해 샘플을 투석한다. 투석48시간 투석을 3회 신선한 버퍼로 교환하고 투석관에서 샘플을 채취한다. 30킬로톤 컷오프가 있는 울트라 여과 장치를 사용하여 샘플을 다시 100 마이크로리터로 농축하고 280나노미터의 나노 체피 분광계에 대한 농도를 확인합니다.
디머를 준비하려면 아포엔자를 50 밀리머 MOPS와 0.5 의 어금니 암모늄 황산염으로 1마이크로몰라 농도로 희석시키고, 75°C의 건조 목욕에서 2시간 동안 반응을 배양한다. 그런 다음 효소 샘플을 적어도 50 마이크로리터 농도로 농축하고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분자량을 확인합니다. 단백질 결정의 모양, 크기 및 결정성을 향상시키기 위해 크리스탈 액적 부피를 10 마이크로리터로 가져오기 위해 최적화된 결정화 용액의 적절한 부피를 결정 방울에 첨가합니다.
액적을 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮기고 90마이크로리터의 결정화 용액을 잘 시드에 추가합니다. 각 종자 희석에 대해, 결정화 플레이트에 적절한 수의 우물에 500 마이크로리터를 넣고 결정화 시약2개 소리터와 0.2 마이크로리터의 단백질 시료를 잘 혼합한다. 그런 다음 결정화 시약의 각 웰에 지원을 수정합니다.
크리스탈 따기의 경우, 액체 질소로 목욕을 채우고 질소로 샘플 처리에 사용되는 바이알이나 바구니를 떨어 세웁니다. 액체 질소를 취급하는 것은 심각한 동상을 일으킬 수 있습니다 위험합니다. 극저온 장갑과 보호 눈 고글과 같은 적절한 개별 보호 기능을 착용하십시오.
결정 크기에 따라 다양한 크기의 샘플 따기 루프를 설정하고 쌍안경을 사용하여 크리스탈을 포함하는 방울을 선택합니다. 그런 다음 루프를 사용하여 하나의 우물에서 분리된 크리스탈을 부드럽게 선택하고 루프를 적절한 바이알에 넣기 전에 즉시 액체 질소로 루프를 급락시합니다. 회절 점 강도를 측정하려면 XDS가 실행되는 폴더를 만들고 이미지에 대한 경로를 찾습니다.
xdsme을 실행하려면 터미널 창에서 명령을 입력합니다. XDS가 작업을 종료한 후 올바른 LP 파일을 확인하고 공간 그룹 결정, 데이터 완전성, 가장 높은 해상도, 크리스탈 모사이시티 및 데이터 품질의 확률을 기록합니다. XDS 무의미한 로그를 확인하여 공간 그룹의 가능성을 얻은 후 명령을 사용하여 XDS에서 제안한 다른 공간 그룹 솔루션으로 xdsme을 다시 실행하여 이전 프로세스를 재정의하지 않도록 합니다.
데이터 통계를 기반으로 최상의 솔루션을 선택한 후 명령을 입력하여 XSCALE 및 XDSCONV를 실행합니다. 비정상적인 산란 항목없이 위상을 확인하려면 4P X, Y 좌표를 사용하여 분자 교체를위한 시작 모델을 준비하십시오. PDB 파일에서 Phenix PDB 파일 편집기를 사용하여 A 단조근을 추출하고 알란에서 아미노산을 잘라.
XDSCONV에서 생성된 반사 파일과 입력으로 시퀀스를 분류하여 X를 실행합니다. Xtriage에서 로그 파일을 확인합니다. 완전성, 비대칭 단위의 하위 단위 수, 이불트로피, 얼음 고리의 존재 및 트위닝 발생에 유의하십시오.
분자 교체를 위해 Phenix에서 Phaser-MR을 실행하려면 폴리알라닌으로 잘린 반사 파일, 서열 및 시작 4P 6 Y 모델을 선택하고 실행을 클릭합니다. 완료되면 모델이 발견되었는지 확인하고 분자 대체 점수를 확인하십시오. 최소 8의 번역 계수 Z 점수는 솔루션이 결정적으로 정확하다는 것을 나타냅니다.
분자 교체에 의해 위상을 결정한 후 자동 빌드 실행을 선택하고 실행을 클릭합니다. 필요한 모든 파일이 자동으로 추가됩니다. 완료되면 COOT의 전자 밀도 맵에 따라 COOT에서 모델을 확인하고 모델을 수동으로 빌드하고 구체화합니다.
이 모델을 사용하여 시퀀스와 회절 데이터를 입력으로 사용하여 Phenix에서 수동으로 선별된 모델을 구체화하여 Phenix를 참조하여 올바른 전략을 선택하는 데 도움을 줍니다. 개선 결과 확인 후, 개선 무료 및 정제 작업이 감소해야합니다. MolProbity 지표를 존중해야 하며 실제 공간 상관 관계가 낮은 이상값은 제한되어야 합니다.
최상의 정제 모델이 생성되면 서버에서 MolProbity를 실행하고 프로그램에서 식별한 이상값을 확인합니다. 크기 배제 크로마토그래피는 정제 된 단백질의 명백한 분자량을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 펩티드의 결정화 상태는, 이량제의 상태 의 주위에 PEG 농도 대 pH를 변화시킴으로써 최적화될 수 있다.
예를 들어, 최고의 TmPep1050 H60A H307A 결정은, 마이크로 결정성을 향상시키기 위해 마이크로 시딩의 1주기 후에 5.2 및 20%PEG 3350 농도의 pH를 가진 0.1 어금다산나트륨 구연산체에서 얻어졌다. 이 분석에서, 데이터 색인은 TmPep1050 H60A H307A 결정의 공간 그룹이 C2221이었다는 것을 보여주었지만, XDS는 또 다른 해결책인 MP 스페이스 그룹을 제안했다. TmPep1050 H60A H307A의 구조는 자동화 및 수동 세련미의 여러 주기 후에 완료될 수 있습니다.
단량체 와 두더지 당 마이너스 16.2 킬로 칼로리의 인터페이스 형성의 자유 에너지 사이의 1, 710 평방 곡스트롬의 인터페이스 표면으로 올리고메릭 상태를 확인합니다. 여기서, TmPep1050 의 활성 부위에 비해 TmPep1050 H307A 활성 부위의 클로즈업을 관찰할 수 있다. 모델을 구축할 때 전자 밀도에서 보는 것만 빌드하여 해석, 데이터를 과도하게 방지하고 모델을 연마하는 데 시간을 할애하십시오.
이머와 도데카메르의 분자량은 또한 네이티브 질량 분석법에 의해 결정될 수 있습니다. 그리고 이 방법은 전환 올리고머를 검출하는 데 유용할 수 있다.
