Ce protocole facilite l’étude des aminopeptidases avec différents états oligomériques et activités oligomerization-dépendantes qui sont équilibrées entre les dimers inactifs et les dodecamers actifs. Cette technique conventionnelle peut être facilement effectuée dans n’importe quel laboratoire. Et en dehors d’exiger l’accès à une ligne de faisceau ou une installation de cristallographie aux rayons X, ne nécessite pas d’appareils spéciaux.
Avec une certaine adaptation, cette méthode peut être appliquée à toute autre protéine ayant une activité ou une fonction qui dépend de son degré d’oligomérisation. Pour traiter les données aux rayons X, les utilisateurs doivent avoir une compréhension minimale de la cristallographie. Nous invitons les utilisateurs à suivre des formations, à visiter XDS Wiki et à regarder les tutoriels Phenix.
Pour effectuer un test d’activité, ajouter 25 microlitres de 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide à 965 microlitres de MOPS de 50 millimlaires, 250 micromolaire cobalt deux chlorure et 10% méthanol Pré incuber le mélange de réaction dans un bain sec de 75 degrés Celsius, avant de diluer l’enzyme à une concentration finale d’un micromolaire avec mops supplémentaire de 50 millimolaires. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’une enzyme micromolaire au mélange de réaction et vortex la solution résultante avant de retourner la réaction au bain sec de 75 degrés Celsius pendant pas plus d’une heure. Lorsque la solution est devenue jaune, arrêter la réaction avec un millilitre d’acide acide à 20% et vortex le mélange avant de lui permettre de refroidir à température ambiante.
Ensuite, transférez un aliquot du mélange de réaction à une cellule spectrophotomètre et lisez les absorbants à 410 nanomètres contre un mélange de réaction incubé sans enzyme, comme un contrôle négatif. Pour la préparation de l’apoenzyme, ajouter 10 microlitres de 1, 10-phenanthroline solution de stock à 890 microlitres de 50 millimillons MOPS, 0,5 sulfate d’ammonium molaire et 100 microlitres de TmPep1050 purifié. Vérifiez la perte d’activité à l’aide de l’analyse d’activité telle qu’elle a été démontrée sans ajout de chlorure de cobalt deux.
Après l’analyse, transférer l’échantillon dans un tube de dialyse et dialyser l’échantillon contre 200 millilitres de MOPS millimolaire et 0,5 sulfate d’ammonium molaire à quatre degrés Celsius. Échangez le dialyse avec un tampon frais trois fois pendant la dialyse de 48 heures et recueillez l’échantillon du tube de dialyse. À l’aide d’unités de filtration ultra avec une coupure de 30 kilodaltons, concentrez l’échantillon à 100 microlitres et vérifiez la concentration sur un spectrophotomètre à nano volume à 280 nanomètres.
Pour préparer les dimers diluer l’apoenzyme à une concentration d’un micromolaire en MOPS millimolaire et 0,5 sulfate d’ammonium molaire, et incuber la réaction pendant deux heures dans un bain sec de 75 degrés Celsius. Concentrez ensuite l’échantillon enzymatique jusqu’à la concentration d’au moins 50 microlitres et vérifiez le poids moléculaire par chromatographie d’exclusion de taille. Pour améliorer la forme, la taille et la cristallinité des cristaux protéiques, ajoutez le volume approprié de solution de cristallisation optimisée à une goutte de cristaux pour porter le volume de gouttelettes de cristal à 10 microlitres.
Transférer la gouttelette dans un micro tube de 1,5 millilitre et ajouter 90 microlitres de solution de cristallisation au puits ensemencé. Pour chaque dilution des graines, ajouter 500 microlitres de réagencé de cristallisation par puits au nombre approprié de puits dans une plaque de cristallisation et mélanger deux microlitres d’échantillon protéique avec deux microlitres de rééditant de cristallisation et 0,2 microlitres de graines dans un support de cristallisation par puits. Ensuite, fixez les supports sur chaque puits de réagenage de cristallisation.
Pour la cueillette du cristal, remplissez un bain d’azote liquide et plongez les flacons ou paniers utilisés pour la manipulation de l’échantillon dans l’azote. La manipulation de l’azote liquide est dangereuse, elle peut causer de graves engelures. Assurez-vous de porter des protections individuelles appropriées comme des gants cryogéniques et des lunettes de protection.
Configurer des boucles de cueillette d’échantillons de différentes tailles en fonction de la taille du cristal et utiliser une jumelle pour sélectionner une goutte contenant des cristaux. Ensuite, utilisez une boucle pour sélectionner délicatement un cristal isolé à partir d’un puits et plonger immédiatement la boucle dans de l’azote liquide avant de placer la boucle dans un flacon approprié. Pour mesurer les intensités ponctuelles de diffraction, créez un dossier à partir duquel XDS sera exécuté et localisez le chemin vers les images.
Pour exécuter xdsme, entrez la commande dans une fenêtre terminale. Une fois XDS terminé, vérifiez le fichier lp correct et notez la probabilité de la détermination du groupe spatial, de l’exhaustivité des données, de la résolution la plus élevée, de la mosaïque cristalline et de la qualité des données. Après avoir vérifié le journal inutile XDS pour obtenir la probabilité de groupes spatiaux, utilisez les commandes pour réexécuter xdsme avec différentes solutions de groupe spatial proposées par XDS, dans un dossier séparé pour éviter de passer outre au processus précédent.
Après avoir sélectionné la meilleure solution en fonction des statistiques de données, entrez les commandes pour exécuter les XSCALE et XDSCONV. Pour déterminer la phase sans élément de diffusion anormal, utilisez les coordonnées 4P X, Y, pour préparer le modèle de départ pour le remplacement moléculaire. À partir du fichier PDB, utilisez l’éditeur de fichiers Phenix PDB pour extraire le monomère A et tronquer ses acides aminés dans l’alanine.
Exécutez X trié avec le fichier de réflexion généré par XDSCONV et la séquence sous forme d’entrées. Vérifiez le fichier journal de Xtriage. Notez l’exhaustivité, le nombre de sous-unités dans l’unité asymétrique, l’anisotropie, la présence d’anneaux de glace et l’événement de jumelage.
Pour exécuter Phaser-MR dans Phenix pour le remplacement moléculaire, sélectionnez le fichier de réflexion, la séquence et le modèle 4P six Y de départ tronqué en polyalanine et cliquez sur Exécuter. une fois terminé, vérifiez si un modèle a été trouvé et vérifiez le score du remplacement moléculaire. Un facteur de traduction Z score d’au moins huit, indique que la solution est définitivement correcte.
Après avoir déterminé la phase par remplacement moléculaire, sélectionnez Exécuter la construction automatique et cliquez sur Exécuter. Tous les fichiers requis seront automatiquement ajoutés. Une fois terminé, vérifiez le modèle dans COOT et construisez et affinez le modèle manuellement, selon la carte de densité électronique dans COOT.
En utilisant ce modèle, la séquence et les données de diffraction comme entrées, affiner le modèle manuellement organisé dans Phenix, se référant à Phenix pour aider à sélectionner la bonne stratégie. Après vérification des résultats, le travail de raffinement libre et de raffinement doit diminuer. Les indicateurs molprobité doivent être respectés et les valeurs aberrantes avec une faible corrélation spatiale réelle doivent être limitées.
Lorsque le meilleur modèle raffiné a été généré, exécutez MolProbity sur le serveur et vérifiez toutes les valeurs aberrantes identifiées par le programme. La chromatographie d’exclusion de taille peut être employée pour déterminer le poids moléculaire apparent de la protéine purifiée. L’état de cristallisation du peptide, peut être optimisé en variant le pH par rapport à la concentration peg autour de l’état du dimère.
Par exemple, les meilleurs cristaux TmPep1050 H60A H307A, ont été obtenus dans 0,1 citrate de sodium molaire avec un pH de 5,2 et 20%PEG 3350 concentration, après un cycle de micro semis pour améliorer la micro cristallinité. Dans cette analyse, l’indexation des données a montré que le groupe spatial du cristal TmPep1050 H60A H307A était C2221, mais XDS a proposé une autre solution, le groupe spatial MP. La structure de TmPep1050 H60A H307A, pourrait être achevée après plusieurs cycles de raffinement automatisé et manuel.
Confirmation de l’état oligomérique avec une surface d’interface de 1 710 angstroms carrés entre les monomères et une énergie libre de formation d’interface de moins 16,2 kilocalories par taupe. Ici, un gros plan du site actif TmPep1050 H60A H307A par rapport au site actif du dimère tmpep1050 et du dodecamer peut être observé. Lors de la construction d’un modèle prendre soin de construire seulement ce que vous voyez dans la densité des électrons pour éviter une surinterprétation, les données, et de prendre le temps de polir votre modèle.
Le poids moléculaire du dimère et du dodécaamer peut également être déterminé par spectrométrie de masse indigène. Et les méthodes peuvent être utiles pour détecter les oligomers de transition.
