يسهل هذا البروتوكول دراسة الأمينات باستخدام حالات oligomeric المختلفة والأنشطة المعتمدة على القلة التي يتم موازنةها بين الخافتات غير النشطة وddecamers النشطة. يمكن تنفيذ هذه التقنية التقليدية بسهولة في أي مختبر. وبصرف النظر عن اشتراط الوصول إلى مرفق الأشعة أو الأشعة السينية البلورات، لا يتطلب أجهزة خاصة.
مع بعض التكيف، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي بروتين آخر مع نشاط أو وظيفة التي تعتمد على درجة من oligomerization. لمعالجة بيانات الأشعة السينية، يجب أن يكون لدى المستخدمين فهم الحد الأدنى من البلورات. ندعو المستخدمين لمتابعة التدريبات، لزيارة XDS ويكي، ومشاهدة الدروس فينيكس.
لإجراء فحص نشاط، إضافة 25 ميكرولترات من 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide إلى 965 ميكرولترات من 50 ملليمترا MOPS، 250 ميكرومولار الكوبالت اثنين من كلوريد و 10٪ الميثانول قبل احتضان مزيج التفاعل في حمام جاف 75 درجة مئوية، قبل تخفيف الإنزيم إلى تركيز نهائي واحد ميكرومولر مع إضافية 50 مل. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من إنزيم ميكرومولار واحد إلى مزيج التفاعل ودوامة الحل الناتج قبل إرجاع التفاعل إلى حمام جاف 75 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن ساعة واحدة. عندما تحول المحلول إلى اللون الأصفر، أوقف التفاعل بميليلتر واحد من حمض حمضي بنسبة 20٪، ودوامة الخليط قبل السماح له بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم نقل aliquot من مزيج التفاعل إلى خلية مقياس الطيفية وقراءة ماصة في 410 نانومتر ضد مزيج التفاعل المحتضنة دون انزيم، كتحكم سلبي. لإعداد apoenzyme، إضافة 10 ميكرولترات من 1، 10-phenanthroline حل الأسهم إلى 890 ميكرولترات من 50 مللي كومب، 0.5 كبريتات الأمونيوم المولار و 100 ميكرولترات من TmPep 1050 النقي. تحقق من فقدان النشاط باستخدام فحص النشاط كما هو موضح دون إضافة كلوريد الكوبالت اثنين.
بعد الفحص، نقل العينة إلى أنبوب غسيل الكلى وs dialyze العينة ضد 200 ملليلتر من 50 مللي 50 MOPS و 0.5 كبريتات الأمونيوم الولير في أربع درجات مئوية. تبادل dialysate مع العازلة الطازجة ثلاث مرات خلال غسيل الكلى 48 ساعة وجمع العينة من أنبوب غسيل الكلى. باستخدام وحدات الترشيح فائقة مع قطع 30 كيلودالتون، وتركيز العينة مرة أخرى إلى 100 ميكرولترس والتحقق من التركيز على مقياس الطيفي حجم نانو في 280 نانومتر.
لإعداد الغمامات تمييع apoenzyme إلى تركيز واحد micromolar في 50 ملليميلور MOPS و 0.5 كبريتات الأمونيوم الولير، واحتضان التفاعل لمدة ساعتين في حمام جاف 75 درجة مئوية. ثم ركز عينة الإنزيم إلى ما لا يقل عن 50 تركيز ميكرولتر والتحقق من الوزن الجزيئي حسب حجم استبعاد الكروماتوغرافيا. لتحسين الشكل والحجم والبلورية من بلورات البروتين، إضافة الحجم المناسب من حل التبلور الأمثل إلى قطرة من البلورات لتحقيق حجم قطرات الكريستال إلى 10 ميكرولترات.
نقل قطرات إلى أنبوب صغير 1.5 ملليلتر وإضافة 90 ميكرولترات أكثر من محلول التبلور إلى جيدا المصنف. لكل تخفيف البذور، إضافة 500 ميكرولترات من كاشف التبلور في بئر إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة تبلور ومزيج اثنين من ميكرولترات عينة البروتين مع اثنين من microliters من كاشف التبلور و 0.2 ميكرولترات من البذور في دعم تبلور واحد في بئر. ثم إصلاح يدعم على كل بئر من كاشف التبلور.
لالتقاط الكريستال، وملء حمام مع النيتروجين السائل ويغرق أي قوارير أو سلة تستخدم للتعامل مع عينة في النيتروجين. معالجة النيتروجين السائل أمر خطير يمكن أن يسبب قضمات الصقيع الشديدة. تأكد من ارتداء الحماية الفردية المناسبة مثل القفازات المبردة ونظارات العيون الواقية.
إعداد عينات التقاط الحلقات من أحجام مختلفة وفقا لحجم الكريستال واستخدام منظار لتحديد قطرة تحتوي على بلورات. ثم استخدم حلقة لاختيار بلطف الكريستال معزولة من بئر واحد وعلى الفور يغرق الحلقة في النيتروجين السائل قبل وضع الحلقة في قارورة مناسبة. لقياس شدة البقعة الحيودة، قم بإنشاء مجلد يتم تشغيل XDS منه وتحديد موقع المسار إلى الصور.
لتشغيل xdsme، أدخل الأمر في إطار المحطة الطرفية. بعد أن انتهت XDS التحقق من وظيفة ملف ليرة لبنانية الصحيح وملاحظة احتمال تحديد مجموعة الفضاء ، اكتمال البيانات ، وأعلى دقة ، الكريستال الفسيفساء وجودة البيانات. بعد التحقق من سجل XDS لا طائل منه للحصول على احتمال مجموعات الفضاء ، واستخدام الأوامر لإعادة تشغيل xdsme مع مختلف حلول مجموعة الفضاء المقترحة من قبل XDS ، في مجلد منفصل لتجنب تجاوز العملية السابقة.
بعد تحديد أفضل حل استناداً إلى إحصائيات البيانات، أدخل الأوامر لتشغيل XSCALE و XDSCONV. لتحديد المرحلة دون عنصر مبعثر شاذ، استخدم إحداثيات 4P X، Y، لإعداد نموذج البداية للاستبدال الجزيئي. من ملف PDB استخدام محرر ملف PDB PDB فينيكس لاستخراج مونومر و لاقتطاع الأحماض الأمينية الخاصة به في ألانين.
تشغيل X فرزها مع ملف الانعكاس التي تم إنشاؤها بواسطة XDSCONV والتسلسل كمدخلات. تحقق من ملف السجل من Xtriage. لاحظ اكتمال، وعدد الوحدات الفرعية في وحدة غير المتماثلة، anisotropy، وجود حلقات الجليد وحدوث التوأمة.
لتشغيل Phaser-MR في فينيكس لاستبدال الجزيئية، حدد ملف الانعكاس، تسلسل وبدء 4P ستة نموذج ص اقتطاع في polyalanine وانقر فوق تشغيل. عند الانتهاء، تحقق إذا تم العثور على نموذج والتحقق من درجة الاستبدال الجزيئي. عامل ترجمة Z درجة لا يقل عن ثمانية، يشير إلى أن الحل هو الصحيح نهائيا.
بعد تحديد المرحلة عن طريق الاستبدال الجزيئي، حدد تشغيل البناء التلقائي وانقر فوق تشغيل. سيتم إضافة كافة الملفات المطلوبة تلقائياً. عند الانتهاء، والتحقق من النموذج في COOT وبناء وصقل النموذج يدويا، وفقا لخريطة كثافة الإلكترون في COOT.
باستخدام هذا النموذج، وسلسلة والبيانات الحيود كمدخلات، وصقل نموذج منظم يدويا في فينيكس، في إشارة إلى فينيكس للمساعدة في تحديد الاستراتيجية الصحيحة. بعد صقل تحقق من النتائج، يجب أن تقلل عمل الصقل والصقل. يجب احترام مؤشرات MolProbity و القيم المتطرفة ذات الارتباط المساحي الحقيقي المنخفض ، يجب أن تكون محدودة.
عندما تم إنشاء أفضل نموذج المكررة، تشغيل MolProbity على الخادم والتحقق من أي القيم المتطرفة التي حددها البرنامج. يمكن استخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحديد الوزن الجزيئي الظاهر للبروتين النقي. يمكن تحسين حالة التبلور للببتيد ، من خلال تغيير درجة PH مقابل تركيز PEG حول حالة الغمم.
على سبيل المثال، تم الحصول على أفضل بلورات H60A H307A H60A H60A أفضل، في 0.1 citrate الصوديوم ضرس مع درجة حِسّ 5.2 و 20٪ PEG 3350 تركيز، بعد دورة واحدة من البذر الدقيق لتحسين البلورية الدقيقة. في هذا التحليل، أظهرت فهرسة البيانات أن المجموعة الفضائية من الكريستال H60A H307A H60A H600 كانت C2221، ولكن XDS اقترحت حلا آخر، وهو مجموعة الفضاء MP. هيكل TmPep1050 H60A H307A، يمكن أن تكتمل بعد عدة دورات من الصقل الآلي واليدوي.
تأكيد الدولة القلة مع سطح واجهة من 1، 710 angstroms مربع بين كل من مونومر والطاقة الحرة لتشكيل واجهة من ناقص 16.2 سعرات حرارية لكل الخلد. هنا ، يمكن ملاحظة صورة مقربة من موقع H60A H307A النشط H307A HmPep1050 HmPep1050 مقارنة بالموقع النشط لـ TmPep1050 dimer و dodecamer. عند بناء نموذج الحرص على بناء فقط ما تراه في كثافة الإلكترون لتجنب أكثر من التفسير، والبيانات، وتأخذ من الوقت لتلميع النموذج الخاص بك.
الوزن الجزيئي للدمير وdedecamer يمكن أيضا أن تحدد من قبل الطيف الكتلة المحلية. ويمكن أن تكون الأساليب مفيدة للكشف عن القلة الانتقالية.
