Este protocolo facilita o estudo de aminopeptidases com diferentes estados oligoméricos e atividades dependentes de oligomerização que são equilibradas entre dimers inativos e dodecamers ativos. Esta técnica convencional pode ser facilmente realizada em qualquer laboratório. E além de exigir acesso a uma instalação de cristalografia de raios-X ou raios-X, não requer dispositivos especiais.
Com alguma adaptação, este método pode ser aplicado a qualquer outra proteína com uma atividade ou função que dependa de seu grau de oligomerização. Para processar os dados de raio-x, os usuários devem ter uma compreensão mínima da cristalografia. Convidamos os usuários a seguir os treinamentos, visitar o XDS Wiki e a assistir aos tutoriais da Phenix.
Para realizar um ensaio de atividade, adicionar 25 microlitres de 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide a 965 microliters de 50 milimilas MOPS, 250 micromolar cobalto dois cloreto e 10% metanol Pré incubar a mistura de reação em um banho seco de 75 graus Celsius, antes de diluir a enzima a uma concentração final de um micromolar com mops de 50 mililitros adicionais. Em seguida, adicione 10 microliters de uma enzima micromolar à mistura de reação e vórtice a solução resultante antes de retornar a reação ao banho seco de 75 graus Celsius por não mais do que uma hora. Quando a solução ficar amarela, pare a reação com um mililitro de ácido ácida de 20% e o vórtice da mistura antes de permitir que esfrie à temperatura ambiente.
Em seguida, transfira uma alíquota da mistura de reação para uma célula espectrofotômetro e leia os absorventes a 410 nanômetros contra uma mistura de reação incubada sem enzima, como um controle negativo. Para a preparação da apoenzyme, adicione 10 microlitros de 1, 10-phenanthroline solução de estoque para 890 microlitros de 50 milimilas MOPS, 0,5 sulfato de amônio molar e 100 microlitros de TmPep1050 purificado. Verifique a perda de atividade usando o ensaio de atividade como demonstrado sem a adição de cloreto de cobalto dois.
Após o ensaio, transfira a amostra para um tubo de diálise e diálise a amostra contra 200 mililitros de 50 mililitros mops e 0,5 sulfato de amônio molar a quatro graus Celsius. Troque o diálise com tampão fresco três vezes durante a diálise de 48 horas e colete a amostra do tubo de diálise. Utilizando unidades de ultra filtração com um corte de 30 kilodalton, concentre a amostra de volta a 100 microliters e verifique a concentração em um espectógrafo nano volume a 280 nanômetros.
Para preparar os dimers diluem a apoenzyme a uma concentração de um micromolar em MOPS de 50 mililitros e 0,5 sulfato de amônio molar, e incubar a reação por duas horas em um banho seco de 75 graus Celsius. Em seguida, concentre a amostra de enzimas para quando pelo menos 50 microliter concentração e verifique o peso molecular por cromatografia de exclusão de tamanho. Para melhorar a forma, o tamanho e a cristalinaidade dos cristais proteicos, adicione o volume apropriado de solução de cristalização otimizada a uma gota de cristais para levar o volume de gotícula de cristal a 10 microliters.
Transfira a gota para um micro tubo de 1,5 mililitro e adicione mais 90 microliters de solução de cristalização ao poço semeado. Para cada diluição de sementes, adicione 500 microliters de reagente de cristalização por poços ao número adequado de poços em uma placa de cristalização e misture dois microliters de amostra de proteína com dois microliters de reagente de cristalização e 0,2 microliters de sementes em um suporte de cristalização por poço. Em seguida, fixar os suportes em cada poço de reagente de cristalização.
Para a colheita de cristais, encha um banho com nitrogênio líquido e mergulhe quaisquer frascos ou cestas usadas para manuseio de amostras no nitrogênio. Manusear nitrogênio líquido é perigoso pode causar queimaduras severas. Certifique-se de usar proteções individuais adequadas, como luvas criogênicas e óculos de proteção.
Configure loops de colheita de amostras de diferentes tamanhos de acordo com o tamanho do cristal e use um binóculo para selecionar uma gota contendo cristais. Em seguida, use um laço para selecionar suavemente um cristal isolado de um poço e imediatamente mergulhe o laço em nitrogênio líquido antes de colocar o laço em um frasco adequado. Para medir as intensidades do ponto de difração, crie uma pasta a partir da qual o XDS será executado e localize o caminho para as imagens.
Para executar xdsme, digite o comando em uma janela terminal. Após o término do XDS, verifique o arquivo lp correto e observe a probabilidade da determinação do grupo espacial, completude dos dados, a maior resolução, mosaico cristalino e qualidade dos dados. Depois de verificar o registro sem sentido XDS para obter a probabilidade de grupos espaciais, use os comandos para reexecutar xdsme com diferentes soluções de grupo espacial propostas pelo XDS, em uma pasta separada para evitar sobrepor o processo anterior.
Depois de selecionar a melhor solução com base nas estatísticas de dados, digite os comandos para executar o XSCALE e XDSCONV. Para determinar a fase sem um item de dispersão anômeo, use coordenadas 4P X, Y, para preparar o modelo de partida para substituição molecular. A partir do arquivo PDB, use o editor de arquivos Phenix PDB para extrair o monômero A e para truncar seus aminoácidos em alanina.
Execute X triagem com o arquivo de reflexão gerado por XDSCONV e a sequência como entradas. Verifique o arquivo de registro de Xtriage. Note a completude, o número de subunidades na unidade assimétrica, a anisotropia, a presença de anéis de gelo e a ocorrência de twinning.
Para executar Phaser-MR em Phenix para substituição molecular, selecione o arquivo de reflexão, a sequência e o modelo 4P 4P Y inicial truncado em polialanina e clique em Executar. após a conclusão, verifique se um modelo foi encontrado e verifique a pontuação da substituição molecular. Uma pontuação do fator de tradução Z de pelo menos oito, indica que a solução está definitivamente correta.
Depois de determinar a fase por substituição molecular, selecione Executar auto compilação e clique em Executar. Todos os arquivos necessários serão adicionados automaticamente. Após a conclusão, verifique o modelo em COOT e construa e refine o modelo manualmente, de acordo com o mapa de densidade eletrônica em COOT.
Usando este modelo, a sequência e os dados de difração como entradas, refine o modelo com curadoria manual em Phenix, referindo-se à Phenix para ajudar a selecionar a estratégia certa. Após a verificação do refinamento dos resultados, o trabalho livre de refinamento e refinamento deve diminuir. Os indicadores molprobity devem ser respeitados e os outliers com baixa correlação de espaço real devem ser limitados.
Quando o modelo mais refinado tiver sido gerado, execute o MolProbity no servidor e confira quaisquer outliers identificados pelo programa. A cromatografia de exclusão de tamanho pode ser usada para determinar o peso molecular aparente da proteína purificada. A condição de cristalização do peptídeo pode ser otimizada variando o pH versus a concentração PEG em torno da condição do mais fraco.
Por exemplo, os melhores cristais TmPep1050 H60A H307A, foram obtidos em citrato de sódio molar 0,1 com pH de 5,2 e 20%PEG 3350 de concentração, após um ciclo de micro semeadura para melhorar a micro cristalina. Nesta análise, a indexação dos dados mostrou que o grupo espacial do cristal TmPep1050 H60A H307A era C2221, mas o XDS propôs outra solução, o grupo espacial MP. A estrutura do TmPep1050 H60A H307A, poderia ser concluída após vários ciclos de refinamento automatizado e manual.
Confirmando o estado oligomerico com uma superfície de interface de 1.710 angstroms quadrados entre ambos os monômeros e uma energia livre de formação de interface de menos 16,2 quilocalorias por toupeira. Aqui, um close-up do site ativo TmPep1050 H60A H307A em comparação com o local ativo do dimer TmPep1050 e dodecamer pode ser observado. Ao construir um modelo, tome cuidado para construir apenas o que você vê na densidade de elétrons para evitar excesso de interpretação, os dados e ter tempo para polir seu modelo.
O peso molecular do dimer e dodecamer também pode ser determinado pela espectrometria de massa nativa. E os métodos podem ser úteis para detectar oligômeros de transição.
