本协议在草药中连续测量大肠杆菌的遗传电路,并计算单个细菌细胞中的信号变异性和信号噪声比,以评估电路性能。该技术的主要优点是,它易于适应不同的菌株和实验室,需要最少的培训,没有特殊设备,而且价格相对便宜。噪音在决定生物系统的功能方面起着重要作用。
目前,人们有兴趣建立大规模的基因电路。这些系统可以受到噪音的抑制,请务必将样品干燥好,尽可能长时间地将冷却垫保持在摄氏四度,并耐心而温和地切割和分割部件。为分析准备细菌,从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。
例如,与 GFP 记者的电路。在含有五毫升LB汤的玻璃管中,用相关抗生素补充。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时,直到汤多云。
在孵化结束时,在两毫升迷你离心机中旋转一毫升稀释溶液,并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到一个新的两毫升管中。然后,在将 40 到 60 微升悬浮剂播种到 M9 培养板上之前,先用摇晃将培养子孵育一小时。为了使细菌为分析做好准备,从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。
例如,一个装有GFP记者的电路在玻璃管中含有五毫升的LB汤,并辅以相关的抗生素。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时,直到汤多云。在孵化结束时,在两毫升迷你离心管中旋转一毫升稀释溶液,并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到新的两毫升管中。
然后用震动孵育文化一小时。要准备显微镜板,将 112.5 毫克低熔化的 agar 与 40 毫克的 agar 混合,在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中混合 1 毫升 2% 的卡萨米诺酸。接下来,在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶的内唇上加入 8.92 毫升的最小介质,并在短短两到三秒内微波处理由此产生的溶液。
然后将水浴温度设置为 55 摄氏度。当溶液清晰时,将 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶放在 60 摄氏度的水浴中,让 agar 溶液冷却,直到温度降至约 45 至 50 摄氏度。在阿加冷却时,用 70% 乙醇清洁实验室长凳,并将一块实验室胶带平滑到清洁的长凳上。
将一个玻璃盖滑到磁带上,并在附近放置第二个盖片。将冷却的阿加溶液添加到适当的抗生素和溶液中。将 1.5 毫升新鲜准备的凝胶溶液倒入放在胶带上的盖片上,并将第二个盖滑倒到凝胶上,小心避免气泡。
将 Erlenmeyer 返回热水浴池,盖住盖子 20 分钟。翻转盖片,在摄氏四度下孵化一小时。在孵化结束时,从干凝胶中取出盖片,从蔗糖中切下一个小垫子。
在孵化过程中,将制备细菌悬浮液中的六个微滑液滴加入 35 毫米的盘中,使滴子干燥至少 15 至 30 分钟。然后小心地将垫子一次放置在一滴细菌上,让样品在室温下放置20分钟。要放置 agar 床而不涂抹样品,请小心地将冷却垫放在液滴上,轻轻敲击。
要对样品进行成像,请从水中取出烧瓶,并让凝胶溶液冷却至体温。将三毫米的凝胶倒入样品板的外围。当糖体凝固后,用胶带密封板,并用25米针将几个孔插入胶带中。
然后将盘子倒置在摄氏4度,至少30分钟,使糖体完全凝固,同时防止细胞间质疏松。在 24 小时内,使用荧光共聚焦显微镜将样品定位在最低放大倍率,并采用显微镜的自动对焦系统。将油涂抹在适当的目标上,并使用平台控制器移动板,以小心地铺开油。
然后再次进行自动对焦,并按照 Z 步横截面的默认建议对示例进行映像。大肠杆菌应在白色背景上显示为黑色长方形。发光的动态范围应该显示其中心的峰值。
30分钟后,荧光显微镜可首先检测到线粒体事件。虽然单个细胞在低倍率下可能难以检测。以不正确的稀释比率制备的细菌细胞培养物可以证明细胞数量不变,而未密封板的样品可能表现出过度收缩,导致注意力丧失。
细胞还可以在寻找营养物质时吸收凝胶,导致细菌细胞相互叠叠,并损害细胞单层,有效防止细胞检测和可靠的荧光信号测量。根据这些数据的建议,分裂周期中的单元格阶段不影响噪声水平,因为不同区域范围表现出相同的趋势。此外,GFP 和超级倍频 GFP 之间的信号与噪声比率没有显著变化,这些代表性数据就说明了这一点。
执行此程序时,请注意确定用于实验的细菌菌株的正确稀释比。将每个受监管电路的信号噪声比与此基线进行比较,可以选择最佳性能电路,并揭示有趣的现象