이 프로토콜은 대장균에서 유전 회로의 연속 측정과 회로 성능을 평가하기 위해 개별 세균 세포에서 신호 가변성 및 신호 대 잡음 비율의 계산이다. 이 기술의 주요 장점은 다른 균주와 실험실에 쉽게 적응할 수 있고 최소한의 훈련과 특수 장비가 필요하며 상대적으로 저렴하다는 것입니다. 노이즈는 생물학적 시스템의 기능을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다.
현재, 대규모 유전자 회로 를 구축에 관심이 있다. 이러한 시스템은 소음에 의해 억제 될 수 있습니다 잘 샘플을 건조, 가능한 한 오랫동안 섭씨 4도에서 그 냉각 패드를 유지하고, 잘라 내고 환자를 부드럽게 부품을 분할. 분석을 위해 박테리아를 준비하기 위해 감염된 대장균 배양으로부터 단일 식민지를 접종한다.
예를 들어 GFP 리포터가 있는 회로입니다. LB 국물의 5 밀리 리터를 포함 하는 유리 튜브에서 관련 항생제와 보충. 국물이 흐릴 때까지 2 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 분당 250 회전에서 세포를 성장시면 됩니다.
인큐베이션의 끝에서, 2 밀리리터 미니 마이크로 원심분리기에서 희석 용액의 1 밀리리터를 스핀다운하고, 30 마이크로리터의 박테리아와 희석 용액의 전체 부피를 새로운 2밀리리터 튜브로 옮겨넣습니다. 그런 다음 이 서스펜션의 40~60마이크로리터를 M9 배양판에 시드하기 전에 흔들림으로 1시간 동안 배양합니다. 분석을 위해 박테리아를 준비하려면, 전염된 대장균 배양에서 단일 식민지를 접종한다.
예를 들어, 관련 항생제로 보충된 LB 국물의 5밀리리터를 포함하는 유리 튜브에서 GFP 기자를 가진 회로. 국물이 흐릴 때까지 2 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 분당 250 회전에서 세포를 성장시면 됩니다. 인큐베이션의 끝에서, 2 밀리리터 미니 마이크로 원심 분리기 튜브에 희석 용액의 1 밀리리터를 스핀 다운하고 새로운 2 밀리리터 튜브로 30 마이크로 리터의 박테리아와 희석 용액의 전체 볼륨을 전송합니다.
그런 다음 흔들어 1 시간 동안 문화를 배양. 현미경 플레이트를 준비하려면 112.5 밀리그램의 저용 한천과 40 밀리그램의 천, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에 2%카산산 1밀리리터를 섞습니다. 다음으로, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크의 안쪽 입술에 8.92 밀리리터를 추가하고 그 결과 용액을 2~3초 의 짧은 버스트로 전자레인지에 넣습니다.
그런 다음 수조를 섭씨 55도로 설정합니다. 용액이 명확할 때, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크를 섭씨 60도의 수조에 놓고 온도가 섭씨 45~50도까지 떨어질 때까지 한천 용액이 식을 수 있도록 합니다. 한천이 냉각되는 동안 실험실 벤치를 70%에탄올로 청소하고 실험실 테이프를 청소된 벤치에 부드럽게 발라줍니다.
유리 커버 1개를 테이프에 놓고 두 번째 커버 슬립을 가까이 놓습니다. 적절한 항생제와 용액에 냉각 된 한천 용액을 추가하십시오. 1.5 밀리리터를 테이프 위에 놓은 커버 슬립에 젤 용액을 젤로 넣고 두 번째 커버 슬립을 젤에 올려 거품을 피하십시오.
에를렌마이어를 온수 욕조로 돌려보내 커버 슬립을 20분 간 덮습니다. 덮개 전표를 섭씨 4도에서 1시간 동안 잠식합니다. 인큐베이션의 끝에서, 마른 젤에서 커버 슬립을 제거하고 아가로즈에서 작은 패드를 잘라.
인큐베이션 하는 동안, 35 밀리 미터 접시에 준비 된 세균 현탁액의 6 개의 마이크로 리터 방울을 추가 하 고 적어도 15 받는 르 30 분 동안 건조 방울을 허용. 그런 다음 조심스럽게 박테리아의 한 방울에 한 번에 패드를 배치하고 샘플이 실온에서 20 분 동안 설정할 수 있습니다. 샘플을 얼룩지게하지 않고 한천 침대를 배치하려면 부드러운 탭으로 시원한 패드를 물방울에 조심스럽게 놓습니다.
샘플을 이미지화하려면 물에서 플라스크를 제거하고 젤 용액이 체온으로 냉각되도록 하십시오. 3밀리미터의 젤을 샘플 플레이트 둘레에 붓습니다. 아가로즈가 고화되면 테이프로 플레이트를 밀봉하고 25 게이지 바늘을 사용하여 테이프에 여러 개의 구멍을 부수습니다.
그런 다음 아가로즈가 완전히 응고할 수 있도록 최대 30분 동안 4°C의 거꾸로 판을 거꾸로 놓으면서 세포 미토시스를 방지합니다. 24시간 이내에 형광 공초점 현미경을 사용하여 가장 낮은 배율에서 샘플을 찾고 현미경의 자동 초점 시스템을 참여시다. 적절한 목표에 오일을 적용하고 플랫폼 컨트롤러를 사용하여 플레이트를 이동하여 오일을 조심스럽게 확산시다.
그런 다음 자동 초점을 다시 참여시키고 Z 단계 단면에 대한 기본 제안을 따라 샘플을 이미지화합니다. 대장균은 흰색 배경이 떨어져 있는 검은 색 직사각형 모양으로 나타나야 합니다. 그리고 휘도의 동적 범위는 중앙에 스파이크를 보여야한다.
미토시스 이벤트는 30분 후에 형광 현미경 검사법에 의해 먼저 검출될 수 있습니다. 개별 세포는 낮은 배율에서 검출하기 어려울 수 있더라도. 잘못된 희석 비로 제조된 세균성 세포 배양은 변하지 않는 수의 세포를 입증할 수 있으며, 플레이트 밀봉 없이 제조된 시료는 과도한 수축을 나타낼 수 있어 집중력상실을 초래할 수 있다.
세포는 또한 영양소를 검색하는 데 젤을 들여주어 세균 세포가 서로 겹쳐서 세포 단층을 손상시키며 세포 감지 및 신뢰할 수 있는 형광 신호 측정을 효과적으로 방지할 수 있습니다. 이러한 데이터에 의해 제안된 바와 같이, 분할 주기의 셀 스테이지는 다양한 영역 범위가 동일한 추세를 나타내므로 노이즈 레벨에 영향을 미치지 않습니다. 또한 이러한 대표적인 데이터에 의해 설명된 바와 같이 GFP와 초폴드 GFP 간에는 신호 대 잡음 비율의 실질적인 변화가 관찰되지 않는다.
이 절차를 수행할 때, 실험에 사용되는 세균 균주에 대한 올바른 희석 비율을 결정하기 위해 주의하십시오. 각 조절 회로의 신호 대 잡음 비율을 이 베이스 라인과 비교하면 최고의 성능 회로를 선택할 수 있으며 흥미로운 현상을 드러낼 수 있습니다.
