改进的高通量DNA提取板加载方法，降低污染的可能性

该协议为提高96井DNA提取板加载效率提供了一种技术，同时降低了样品交叉污染的风险。该技术通过向 96 井板中的每一个井单独添加样品，在 DNA 提取的关键第一步中减少污染的机会。这种方法可应用于微生物群研究的任何不同领域。

在开始实验之前，用70%乙醇雾化工作台顶。擦拭后，让长凳风干，然后用10%的漂白剂喷洒工作台。擦拭和空气干燥后，将微镜、铲子和弯曲的手术剪刀浸入 95% 乙醇中，将工具暴露在火焰中。

然后将每个工具浸入 10% 漂白剂中，让工具风干。在进行亚采样之前，乙醇对手套进行消毒，使土壤样品完全均质化。接下来为每个管分配一个具有井位置的示例 ID。

将 95 标有两毫升离心管，每管一个样品，直到每个管大约半满。第 96 管应用作提取空白。将亚样品管放在冰上，根据 96 井板的井标标签，将 96 个无菌 200 微升平盖 PCR 管贴上标签，然后将标签 200 微升管按顺序放在 96 井机架中。

要为实验准备 96 孔板，请从板上取下盖子，将盖放入无菌塑料袋中。密封袋子以防止污染，用预切的可刺穿密封膜盖住板。然后使用橡胶辊将密封件牢牢地固定在板上，并在四摄氏度下存放板。

要将亚样品转移到板材中，请将两毫升亚样品管中的 24 个放入冰块中进行冷库，并使用样品名称和井位表选择相应的 200 微升平顶管。一次一次对子样品进行涡流，每个样品5秒钟，以确保均质化，将每个样品的约200微升加载到相应的PCR管中。当所有 24 个样品都已加载后，使用漂白浸泡的纸擦拭来清洁一个 PCR 管的外端，然后反转并敲击工作台上的管子，将样品移动到管的顶部。

使用火焰灭菌和漂白剪刀夹住 PCR 管的底部，为样品创建开口，并在切割端朝上，直到到达适当的孔之前将管子穿过板。稍微倾斜板，便于刺穿预切割的可刺穿密封膜，并用管直接上方正确的井，快速但小心地反转板，使切割尖端适合井。使用消毒工具敲击管的顶部，直到所有土壤从管子掉入井中。

将管子留在井中，将铅闭合。当所有样品均以相同方式加载时，拆下一个 200 微升平盖 PCR 管，并将 750 微升珠溶液添加到样品井中。将 200 微升平盖 PCR 管放回井中，一直向下推入井中。

并使用夏皮标记管的顶部，以指示井已加载。当所有井都装有珠子后，将 24 个样品管返回 20 摄氏度的存储，并在冰块中添加 24 个新的亚样品管，以便像刚才所示，将下一组样品装入 96 孔板中。当所有 95 口油井都装有样品和珠子溶液时，仅向第 96 口油井添加珠子溶液。

拆下所有管子，仅将其穿过覆盖的孔，并小心地从板中取下可刺穿的薄膜。然后小心地将板盖从塑料袋转移到板上，将板在 20 摄氏度处放置，直到按计划提取。对板载荷方法的比较表明，所演示的方法在空白井中产生最低的DNA浓度。

使用这种方法，DNA浓度明显低于使用麦克弗森等人提出的方法。虽然该方法的DNA浓度与齐根默认方法在统计学上没有差异。这三种方法，产生平均DNA浓度低于两纳米每微升。

虽然只有这种新方法产生没有可测量DNA浓度的井。为了尽量减少溢出的可能性，在将 200 微升管在板上移动时保持直立，倾斜板并将其插入正确的井中。