Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Steigerung der Effizienz der 96-Well-DNA-Extraktionsplattenbelastung bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Probenkreuzkontamination. Diese Technik reduziert die Kontaminationschancen während des kritischen ersten Schritts der DNA-Extraktion durch die individuelle Zugabe von Proben zu jedem Brunnen in der 96-Well-Platte. Diese Methode kann auf alle bereiche der Mikrobiomforschung angewendet werden.
Bevor Sie ein Experiment beginnen, vernebeln Sie die Bank mit 70% Ethanol. Nach dem Wischen die Bank lufttrocknen lassen, bevor sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprüht. Nach dem Wischen und Der Lufttrocknung tauchen Sie die mikroskopuläre, spatuläre und gekrümmte chirurgische Schere in 95% Ethanol und setzen die Werkzeuge einer Flamme aus.
Dann tauchen Sie jedes Werkzeug in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Werkzeuge lufttrocknen. Vor der Unterprobe sterilisiert Ethanol Handschuhe und homogenisiert die Bodenproben gründlich. Weisen Sie als Nächstes jedem Rohr eine Beispiel-ID mit Brunnenposition zu.
Füllen Sie 95 beschriftete zwei Milliliter Zentrifugenrohre mit einer Probe pro Tube, bis jedes Rohr etwa halb voll ist. Das 96. Rohr sollte als Extraktionsrohling verwendet werden. Legen Sie die Sub-Probenröhrchen auf Eis und beschriften Sie 96 sterile 200 Mikroliter flach gekappte PCR-Röhren entsprechend den Well-Etiketten für eine 96-Well-Platte, und legen Sie dann das Etikett 200 Mikroliter-Röhren in einem 96-Well-Rack in Ordnung.
Um eine 96-Well-Platte für das Experiment vorzubereiten, entfernen Sie die Abdeckung von der Platte und legen Sie die Abdeckung in eine sterile Plastiktüte. Versiegeln Sie den Beutel, um eine Kontamination zu vermeiden, und bedecken Sie die Platte mit einem vorgeschnittenen Stück durchbohrbarer Dichtfolie. Dann verwenden Sie eine Gummiwalze, um die Dichtung fest auf der Platte zu befestigen und die Platte bei vier Grad Celsius zu lagern.
Um die Unterproben auf die Platte zu übertragen, legen Sie 24 der zwei Milliliter-Unterprobenröhrchen zur Kaltlagerung in einen Eisblock und wählen Sie anhand des Probennamens und des Gut-Lagebogens die entsprechenden 200 Mikroliter Flachkappenrohre aus. Wirbeln Sie die Subproben nacheinander für fünf Sekunden pro Probe, um die Homogenisierung zu gewährleisten und laden Sie ca. 200 Mikroliter jeder Probe in das entsprechende pcR-Rohr. Wenn alle 24 Proben geladen wurden, verwenden Sie ein gebleichtes getränktes Papiertuch, um die Außenseite eines PCR-Rohrs zu reinigen, und invertiert und tippen Sie auf das Rohr auf der Bank, um die Probe an die Oberseite des Rohres zu bewegen.
Mit der Flamme sterilisierte und gebleichte Schere Clip die Unterseite des PCR-Rohrs, um eine Öffnung für die Probe zu schaffen, und übergeben Sie das Rohr über die Platte mit dem Schnitt Ende nach oben, bis der entsprechende Brunnen erreicht ist. Neigen Sie die Platte leicht, um das Punktieren der vorgeschnittenen pierceablen Dichtfolie zu erleichtern, und mit dem Rohr direkt über dem richtigen Brunnen, schnell, aber vorsichtig invertieren Sie die Platte, so dass die geschnittene Spitze in den Brunnen passt. Verwenden Sie ein sterilisiertes Werkzeug, um die Oberseite des Rohres zu tippen, bis der gesamte Boden aus dem Rohr in den Brunnen gefallen ist.
Und lassen Sie die Röhre im Brunnen mit der Leitung geschlossen. Wenn alle Proben auf die gleiche Weise geladen wurden, entfernen Sie ein 200 Mikroliter flachkappendes PCR-Rohr und fügen Sie der Probe 750 Mikroliter Perlenlösung hinzu. Legen Sie das 200 Mikroliter flache PCR-Rohr wieder in den Brunnen, der es den ganzen Weg hinunter in den Brunnen drückt.
Und verwenden Sie einen Sharpie, um die Oberseite des Rohres zu markieren, um anzuzeigen, dass der Brunnen geladen wurde. Wenn alle Brunnen mit Perlen beladen sind, kehren die 24 Probenröhrchen auf 20 Grad Celsius Lagerung zurück und fügen 24 neue Sub-Probenröhren in den Eisblock, damit der nächste Satz von Proben in die 96-Well-Platte geladen werden kann, wie gerade gezeigt. Wenn alle 95 Brunnen mit Proben- und Perlenlösung beladen wurden, fügen Sie die Perlenlösung nur zum 96. Brunnen hinzu.
Entfernen Sie alle Rohre, übergeben Sie sie nur über überdachte Brunnen und entfernen Sie vorsichtig den durchbohrbaren Film von der Platte. Dann die Plattenabdeckung vorsichtig aus dem Plastikbeutel auf die Platte geben und die Platte bis zur geplanten Extraktion bei 20 Grad Celsius platzieren. Ein Vergleich der Plattenlademethoden zeigt, dass die demonstrierte Methode zu der niedrigsten DNA-Konzentration in den Rohbrunnen führt.
Mit dieser Methode war die DNA-Konzentration signifikant niedriger als bei der Anwendung der von McPherson et al. vorgeschlagenen Methode. Obwohl die DNA-Konzentration nach dieser Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode abdifferenzierunge. Alle drei Methoden produzieren mittlere DNA-Konzentrationen unter zwei Nanogramm pro Mikroliter.
Obwohl nur diese neue Methode Brunnen ohne messbare DNA-Konzentration produziert. Um das Verschüttungspotenzial zu minimieren, halten Sie das 200-Mikroliter-Rohr aufrecht, wenn Sie es über die Platte bewegen, kippen Sie die Platte und setzen Sie das Rohr in den richtigen Brunnen ein.
