Этот протокол обеспечивает метод для повышения эффективности 96-ну экстракции ДНК пластины загрузки при одновременном снижении риска перекрестного загрязнения образца. Этот метод снижает шансы на загрязнение на критическом первом этапе извлечения ДНК за счет индивидуального добавления образцов к каждой пластине в пластине 96-колодец. Эта методология может быть применена к любой из различных областей исследований микробиома.
Перед началом эксперимента, туман скамейке сверху с 70%этанола. После вытирания, пусть скамейке воздуха сухой, прежде чем распылять скамейке с 10%bleach. После вытирания и сушки воздуха, окунуть микроскопические, шпакулярные и изогнутые хирургические ножницы в 95% этанола и подвергать инструменты пламени.
Затем окуните каждый инструмент в 10%отбеливатель и позволить инструментам высушить воздух. Перед подпробами этанол стерилизуют перчатки и тщательно гомогенизируют образцы почвы. Затем назначьте идентификатор образца с расположением хорошо для каждой трубки.
Заполните 95 помечены два миллилитровых центрифуг трубки с одним образцом на трубку, пока каждая трубка примерно наполовину заполнены. 96-я трубка должна быть использована в качестве извлечения пустой. Поместите под образец труб на льду, и этикетка 96 стерильных 200 микролитр плоский колпачок ПЦР труб в соответствии с этикетками хорошо для 96-хорошо пластины, а затем поместить этикетку 200 микролитров трубки в порядке в 96-хорошо стойку.
Чтобы подготовить к эксперименту пластину из 96 колодец, снимите крышку с тарелки и поместите крышку в стерильный полиэтиленовый пакет. Печать мешок для предотвращения загрязнения и покрыть пластину с предварительно вырезать кусок прокалываемой герметизации пленки. Затем используйте резиновый ролик, чтобы прочно прилипть печать к пластине и хранить пластину при четырех градусах цельсия.
Для переноса подтефов на пластину поместите 24 из двух миллилитровых под образец труб в ледяную глыму для холодного хранения, а также используйте название образца и лист расположения хорошо, чтобы выбрать соответствующие 200 микролитровых плоских труб. Вихрь подпроб образцов по одному, в течение пяти секунд на образец для обеспечения гомогенизации и нагрузки около 200 микролитров каждого образца в соответствующую трубку ПЦР. Когда все 24 образца были загружены, используйте отбеленные пропитанной бумаги протрите, чтобы очистить снаружи одной трубки ПЦР, и инвертировать и нажмите трубку на скамейке, чтобы переместить образец в верхней части трубки.
Использование пламени стерилизованы и обесцвеченные ножницы клип нижней части трубки ПЦР, чтобы создать отверстие для образца, и пройти трубку над пластиной с разрезом в конце сталкиваются до соответствующего хорошо было достигнуто. Наклоните пластину немного, чтобы облегчить прокол предварительно вырезанной проколоспособной герметизации пленки, и с трубкой непосредственно над правильным хорошо, быстро, но тщательно инвертировать пластину так, что разрез кончик вписывается в колодец. Используйте стерилизованный инструмент, чтобы коснуться верхней части трубки, пока вся почва не упала из трубки в колодец.
И оставить трубку в колодец со свинцом закрыты. Когда все образцы были загружены таким же образом, удалите один 200 микролитр плоский ПЦР трубки и добавить 750 микролитров шариков решение образца хорошо. Поместите 200 микролитр плоский крышкой ПЦР трубки обратно в хорошо толкая его всю дорогу вниз в колодец.
И используйте Sharpie, чтобы отметить верхнюю часть трубки, чтобы указать, что колодец был загружен. Когда все скважины были загружены бисером вернуть 24 образца труб до 20 градусов по Цельсию хранения и добавить 24 новых под образец труб в ледяной глыбой, чтобы следующий набор образцов, которые будут загружены в 96-ну пластины, как только что продемонстрировали. Когда все 95 скважин будут загружены образцом и раствором бисера, добавьте шариковое решение только к 96-й скважине.
Снимите все трубки, передавая их только по крытым колодцам и аккуратно снимите прокалывную пленку с пластины. Затем осторожно перенесите крышку пластины из полиэтиленового пакета на тарелку и поместите пластину при 20 градусах по Цельсию до запланированной добычи. Сравнение методов загрузки пластин показывает, что продемонстрированый метод приводит к наименьшей концентрации ДНК в пустых скважинах.
Используя этот метод, концентрация ДНК была значительно ниже, чем при использовании метода, предложенного McPherson et al. Хотя концентрация ДНК по этому методу статистически не отличалась от метода qiagen по умолчанию. Все три метода, производят средние концентрации ДНК под два нанограмма на микролитер.
Хотя только этот новый метод производит скважины без измеримой концентрации ДНК. Чтобы свести к минимуму потенциал для разлива, держать 200 микролитров трубки вертикально при перемещении его над пластиной, наклонить пластину и вставить трубку в правильный колодец.
