Bu protokol, aynı anda numune çapraz kontaminasyon riskini azaltırken 96 kuyulu DNA ekstraksiyon plakayükleme verimliliğini artırmak için bir teknik sağlar. Bu teknik, 96 kuyulu plakadaki her kuyuya numunelerin ayrı ayrı eklenmesi yle DNA çıkarmanın kritik ilk adımısırasında kontaminasyon olasılığını azaltır. Bu metodoloji mikrobiyom araştırmalarının çeşitli alanlarından herhangi biri için uygulanabilir.
Bir deneye başlamadan önce, %70 etanol ile tezgahın üstünü sisle. Sildikten sonra, tezgaha %10 çamaşır suyu püskürtmeden önce tezgahın havayla kurumasına izin verin. Silme ve hava kurutma sonra, mikroskopular, spatular ve kavisli cerrahi makas daldırma 95% etanol içine ve bir alev aletleri maruz.
Daha sonra her aleti %10 çamaşır suyuna batırın ve aletlerin kurumasını bekleyin. Alt örneklemeden önce, etanol eldivenleri sterilize eder ve toprak örneklerini iyice homojenize eder. Sonraki her tüp için iyi bir konuma sahip bir örnek kimlik atayın.
Her tüp yaklaşık yarı dolu olana kadar, tüp başına bir örnek ile 95 etiketli iki mililitre centrifuge tüpler doldurun. 96. tüp bir ekstraksiyon boş olarak kullanılmalıdır. Alt numune tüplerini buzüzerine yerleştirin ve 96 steril 200 mikrolitre düz kapaklı PCR tüplerini 96 kuyulu bir plaka için kuyu etiketlerine göre etiketlendirin, ardından etiket 200 mikrolitre lik tüpleri 96 kuyulu bir rafa yerleştirin.
Deney için 96 kuyuluk bir plaka hazırlamak için kapağı tabaktan çıkarın ve kapağı steril plastik bir torbaya yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için torbayı kapatın ve plakayı önceden kesilmiş bir delinebilir sızdırmazlık filmi ile kaplayın. Daha sonra mührü sıkıca tabağa yapıştırmak ve plakayı dört santigrat derecede saklamak için kauçuk bir rulo kullanın.
Alt numuneleri tabağa aktarmak için, iki mililitrelik alt numune tüplerinden 24'ünü soğuk depolama için bir buz bloğuna yerleştirin ve uygun karşılık gelen 200 mikrolitrelik düz kapaklı tüpleri seçmek için örnek adı ve iyi konum sayfasını kullanın. Homojenizasyon sağlamak ve her numunenin yaklaşık 200 mikrolitresini uygun pcr tüpüne yüklemek için alt numuneleri birer, numune başına beş saniye boyunca girdaplayın. Örneklerin 24'ünün tamamı yüklendiğinde, bir PCR tüpünün dışını temizlemek için ağartılmış bir kağıt mendil kullanın ve numuneyi tüpün tepesine taşımak için tezgahtaki tüpü ters çevirin ve dokunun.
Alev sterilize ve ağartılmış makas kullanarak pcr tüpünün alt kısmını kesilerek numune için bir açıklık oluşturun ve tüpü, uygun kuyuya ulaşılıncaya kadar kesip plakanın üzerinden geçirin. Önceden kesilebilir sızdırmazlık filminin delinmesini kolaylaştırmak için plakayı hafifçe yatırın ve boru doğrudan doğru kuyunun üzerinde, hızlı ama dikkatlice plakayı ters çevirerek kesme ucunun kuyuya sığmasını sağlar. Tüm toprak tüpten kuyuya düşene kadar tüpün üst dokunun için sterilize bir alet kullanın.
Ve boruyu kuyuda kurşun kapalı bırak. Tüm numuneler aynı şekilde yüklendiğinde, bir 200 mikrolitre düz kapaklı PCR tüp çıkarın ve numuneye iyi bir şekilde 750 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin. 200 mikrolitredüz kapaklı PCR tüpünü kuyuya geri yerleştirin.
Ve kuyunun yüklendiğini göstermek için tüpün üstünü işaretlemek için bir Sharpie kullanın. Tüm kuyular boncuklarla yüklendiğinde 24 numune tüpünü 20 santigrat derece depolamaya geri döndürün ve bir sonraki numune setinin 96 kuyulu plakaya yüklenmesi için buz bloğuna 24 yeni alt numune tüpü ekleyin. Kuyuların 95'inin tamamı numune ve boncuk çözeltisi ile yüklendiğinde, sadece 96.
Sadece kapalı kuyuların üzerinden geçirerek tüm tüpleri çıkarın ve dikkatlice plakadan delinebilir film kaldırın. Daha sonra plaka kapağını plastik torbadan plakaya dikkatlice aktarın ve plakayı planlanan ekstraksiyona kadar 20 derecede yerleştirin. Plaka yükleme yöntemlerinin karşılaştırılması, gösterilen yöntemin boş kuyular içindeki en düşük DNA konsantrasyonu ile sonuçverdiğini göstermektedir.
Bu yöntem kullanılarak McPherson ve arkadaşlarının önerdiği yöntemi kullanırken DNA konsantrasyonu önemli ölçüde daha düşüktü. Bu yöntemle DNA konsantrasyonu istatistiksel olarak qiagen varsayılan yönteminden farklı olmasa da. Her üç yöntem de, mikrolitre başına iki nanogram altında ortalama DNA konsantrasyonları üretir.
Sadece bu yeni yöntem hiçbir ölçülebilir DNA konsantrasyonu ile kuyular üretir rağmen. Dökülme potansiyelini en aza indirmek için, 200 mikrolitrelik tüpü plakanın üzerinde hareket ettirirken dik tutun, plakayı yatırın ve tüpü doğru kuyuya takın.
