Ce protocole fournit une technique pour augmenter l’efficacité du chargement des plaques d’extraction d’ADN de 96 puits tout en réduisant le risque de contamination croisée de l’échantillon. Cette technique réduit les risques de contamination au cours de la première étape critique de l’extraction de l’ADN par l’ajout individuel d’échantillons à chaque puits dans la plaque de 96 puits. Cette méthodologie peut être appliquée à l’un des divers domaines de la recherche sur le microbiome.
Avant de commencer une expérience, vaporiser le dessus du banc avec 70% d’éthanol. Après essuyage, laisser sécher l’air du banc avant de pulvériser le banc avec 10% d’eau de Javel. Après essuyage et séchage à l’air, trempez les ciseaux chirurgicaux microscopiaires, spatulaires et incurvés en 95 % d’éthanol et exposez les outils à une flamme.
Puis trempez chaque outil dans 10% d’eau de Javel et laissez les outils sécher à l’air libre. Avant le sous-échantillonnage, l’éthanol stérilise les gants et homogénéise soigneusement les échantillons de sol. Ensuite, attribuez un iD d’échantillon avec l’emplacement du puits à chaque tube.
Remplissez 95 tubes de centrifugeuse de deux millilitres étiquetés d’un échantillon par tube, jusqu’à ce que chaque tube soit à moitié plein. Le 96e tube doit être utilisé comme blanc d’extraction. Placez les tubes sous-échantillon sur la glace et étiquetez 96 tubes PCR à capuchon plat stériles de 200 microlitres selon les étiquettes du puits pour une plaque de 96 puits, puis placez l’étiquette 200 tubes de microlitre dans l’ordre dans une grille de 96 puits.
Pour préparer une plaque de 96 puits pour l’expérience, retirez le couvercle de la plaque et placez le couvercle dans un sac en plastique stérile. Sceller le sac pour éviter la contamination et couvrir la plaque d’un morceau pré-coupé de film d’étanchéité perçable. Ensuite, utilisez un rouleau de caoutchouc pour coller fermement le joint à la plaque et stocker la plaque à quatre degrés Celsius.
Pour transférer les sous-échantillons à la plaque, placez 24 des deux tubes sous-échantillon millilitres dans un bloc de glace pour l’entreposage frigorifique, et utilisez le nom de l’échantillon et la feuille de localisation du puits pour sélectionner les tubes à cap plat de 200 microlitres appropriés. Vortex les sous-échantillons un à la fois, pendant cinq secondes par échantillon pour assurer l’homogénéisation et charger environ 200 microlitres de chaque échantillon dans le tube PCR correspondant approprié. Lorsque les 24 échantillons ont été chargés, utilisez un lingette en papier trempé blanchi pour nettoyer l’extérieur d’un tube PCR, et inversez et appuyez sur le tube sur le banc pour déplacer l’échantillon vers le haut du tube.
À l’aide de la flamme stérilisée et blanchie ciseaux clip le fond du tube PCR pour créer une ouverture pour l’échantillon, et passer le tube sur la plaque avec l’extrémité coupée face vers le haut jusqu’à ce que le puits approprié a été atteint. Inclinez légèrement la plaque, pour faciliter la ponctuation du film d’étanchéité perçable pré-coupé, et avec le tube directement au-dessus du puits correct, rapidement mais soigneusement inverser la plaque de sorte que la pointe de coupe s’insère dans le puits. Utilisez un outil stérilisé pour appuyez sur le dessus du tube jusqu’à ce que tout le sol soit tombé du tube dans le puits.
Et laissez le tube dans le puits avec le plomb fermé. Lorsque tous les échantillons ont été chargés de la même manière, retirez un tube PCR à cap plat de 200 microlitres et ajoutez 750 microlitres de solution perlée au puits de l’échantillon. Placez le tube PCR à cap plat de 200 microlitres dans le puits en le poussant jusqu’au puits.
Et utilisez un Sharpie pour marquer le haut du tube pour indiquer que le puits a été chargé. Lorsque tous les puits ont été chargés de perles, retournez les 24 tubes de l’échantillon à un stockage de 20 degrés Celsius et ajoutez 24 nouveaux tubes de sous-échantillon au bloc de glace, afin de permettre à la prochaine série d’échantillons d’être chargés dans la plaque de 96 puits comme nous venons de le démontrer. Lorsque les 95 puits ont été chargés avec l’échantillon et la solution de perle, ajoutez la solution de perle seulement au 96ème puits.
Retirez tous les tubes, en les passant sur les puits couverts seulement et retirez soigneusement le film perçable de la plaque. Ensuite, transférez soigneusement le couvercle de la plaque du sac en plastique à la plaque et placez la plaque à 20 degrés Celsius jusqu’à l’extraction prévue. Une comparaison des méthodes de chargement des plaques montre que la méthode démontrée entraîne la plus faible concentration d’ADN dans les puits vierges.
À l’aide de cette méthode, la concentration d’ADN était significativement plus faible que lors de l’utilisation de la méthode proposée par McPherson et coll. Bien que la concentration d’ADN par cette méthode n’étaient pas statistiquement différentes de la méthode par défaut qiagen. Les trois méthodes produisent des concentrations moyennes d’ADN sous deux nanogrammes par microlitre.
Bien que seule cette nouvelle méthode produise des puits sans concentration mesurable d’ADN. Pour minimiser le risque de déversement, maintenez le tube de 200 microlitres droit lorsque vous le déplacez sur la plaque, inclinez la plaque et insérez le tube dans le puits correct.
