このプロトコルは、サンプルクロス汚染のリスクを同時に低減しながら、96ウェルDNA抽出プレートのロードの効率を高める技術を提供します。この技術は、96ウェルプレートの各ウェルにサンプルを個々に添加することにより、DNA抽出の重要な第一段階で汚染の可能性を低減します。この方法論は、マイクロバイオーム研究の多様な分野のいずれかに適用することができます。
実験を始める前に、70%エタノールでベンチトップをミスト。拭いた後、ベンチに10%漂白剤を吹き付ける前に、ベンチを空気乾燥させます。拭いて空気乾燥した後、マイクロスコキュラー、スパタラー、湾曲した外科用はさみを95%エタノールに浸し、ツールを炎にさらします。
その後、各ツールを10%漂白剤に浸し、ツールを空気乾燥させます。サブサンプリングの前に、エタノールは手袋を殺菌し、土壌サンプルを十分に均質化します。次に、各チューブに適切な位置を持つサンプル ID を割り当てます。
各チューブが約半分になるまで、チューブごとに1つのサンプルで2ミリリットル遠心管を標識した95を充填します。第96管は抽出ブランクとして使用されるべきである。氷の上にサブサンプルチューブを置き、96ウェルプレートのウェルラベルに従って96無菌200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブにラベルを付け、ラベル200マイクロリットルチューブを96ウェルラックに順番に配置します。
実験用に96ウェルプレートを準備するには、プレートからカバーを取り外し、カバーを無菌のビニール袋に入れます。袋を密封して汚染を防ぎ、プレートを穿孔可能なシールフィルムで覆います。その後、ゴムローラーを使用してシールをプレートにしっかりと接着し、プレートを摂氏4度で保存します。
サブサンプルをプレートに移すには、2つのミリリットルサブサンプルチューブの24を氷ブロックに入れ、サンプル名とウェル位置シートを使用して、適切な200マイクロリットルのフラットキャップチューブを選択します。サブサンプルを一度に1個ずつ、1サンプルあたり5秒間ボルテックスして均質化を確保し、各サンプルの約200マイクロリットルを適切な対応するPCRチューブにロードします。サンプルの24個すべてがロードされたら、漂白したびれた紙のワイプを使用して1本のPCRチューブの外側を洗浄し、ベンチのチューブを反転してタップしてサンプルをチューブの上部に移動させます。
炎の殺菌および漂白されたはさみを使用して、サンプルの開口部を作成するためにPCRチューブの底をクリップし、適切なウェルに達するまでカットエンドを上に向けてプレートの上にチューブを渡します。プレートを少し傾け、切り込み前の密閉フィルムの穿刺を容易にし、チューブを正しい井戸の真上に置き、切った先端がウェルに収まるようにプレートを素早く慎重に反転させます。すべての土壌がチューブから井戸に落ちるまでチューブの上部をタップするために殺菌ツールを使用してください。
そして、リードを閉じた状態で井戸にチューブを残します。すべてのサンプルが同じ方法でロードされたら、1つの200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを取り除き、750マイクロリットルのビーズ溶液をサンプルウェルに加えます。200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを井戸に戻し、井戸に押し込み、井戸に押し込む。
そして、井戸がロードされていることを示すためにチューブの上部をマークするためにシャーピーを使用してください。すべての井戸にビーズが積み込まれるとき24のサンプル管を摂氏20度の貯蔵に戻し、24個の新しいサブサンプルチューブを氷のブロックに加え、次のサンプルセットを96ウェルプレートに積み込むことができます。95個のウェルすべてにサンプルとビーズ溶液がロードされたら、ビーズ溶液を96番目の井戸にのみ追加します。
すべてのチューブを取り外し、覆われた井戸の上にのみ渡し、慎重にプレートからピアス可能なフィルムを取り除きます。その後、慎重にビニール袋からプレートにプレートカバーを転送し、計画抽出まで20°Cでプレートを置きます。プレートローディング方法の比較は、実証された方法がブランクウェル内で最も低いDNA濃度をもたらすことを示しています。
この方法を用いて、マクファーソンらによって提案された方法を用いた場合、DNA濃度は有意に低かった。この方法によるDNA濃度は、qiagenのデフォルト法と統計的に異なるものではなかった。3つの方法はいずれも、1マイクロリットル当たり2ナノグラム以下の平均DNA濃度を生成する。
この新しい方法だけが測定可能なDNA濃度を持たない井戸を作り出すが。こぼれの可能性を最小限に抑えるには、プレート上で200マイクロリットルチューブを直立に保ち、プレートを傾け、チューブを正しいウェルに挿入します。
