Este protocolo fornece uma técnica para aumentar a eficiência do carregamento da placa de extração de DNA de 96 poços, ao mesmo tempo em que diminui o risco de contaminação cruzada da amostra. Esta técnica reduz as chances de contaminação durante o primeiro passo crítico da extração de DNA através da adição individual de amostras a cada poço na placa de 96 poços. Essa metodologia pode ser aplicada a qualquer um dos diversos campos da pesquisa de microbiomas.
Antes de iniciar uma experiência, misture o topo do banco com 70% de etanol. Depois de limpar, deixe o banco secar o ar antes de pulverizar o banco com 10% de alvejante. Depois de limpar e secar o ar, mergulhe a tesoura cirúrgica microscóscular, espápula e curva em 95% de etanol e exponha as ferramentas a uma chama.
Em seguida, mergulhe cada ferramenta em 10% de alvejante e deixe as ferramentas secarem ao ar. Antes da subamostragem, o etanol esteriliza luvas e homogeneiza minuciosamente as amostras do solo. Em seguida, atribua um ID de amostra com localização do poço em cada tubo.
Encha 95 tubos de centrífugas de mililitro com uma amostra por tubo, até que cada tubo esteja aproximadamente meio cheio. O tubo 96 deve ser usado como um vazio de extração. Coloque os tubos de sub-amostra no gelo, e rotule 96 tubos PCR de tampa plana de 200 microliter de acordo com as etiquetas do poço para uma placa de 96 poços, em seguida, coloque o rótulo de 200 tubos de microliter em ordem em um rack de 96 poços.
Para preparar uma placa de 96 poços para o experimento, remova a tampa da placa e coloque a tampa em um saco plástico estéril. Sele o saco para evitar contaminação e cubra a placa com um pedaço pré-cortado de filme de vedação perfurante. Em seguida, use um rolo de borracha para aderir firmemente o selo à placa e armazenar a placa a quatro graus Celsius.
Para transferir as subamostras para a placa, coloque 24 dos dois tubos de subamostra mililitro em um bloco de gelo para armazenamento a frio e use o nome da amostra e a folha de localização do poço para selecionar os tubos de tampa plana correspondentes correspondentes. Vórtice subamostra um de cada vez, durante cinco segundos por amostra para garantir a homogeneização e carregar aproximadamente 200 microliters de cada amostra no tubo PCR correspondente apropriado. Quando todas as 24 amostras tiverem sido carregadas, use uma limpeza de papel branqueada para limpar o exterior de um tubo PCR, e inverta e toque o tubo no banco para mover a amostra para a parte superior do tubo.
Usando a chama esterilizada e branqueada tesoura clipe a parte inferior do tubo PCR para criar uma abertura para a amostra, e passe o tubo sobre a placa com a extremidade de corte voltada para cima até que o poço apropriado tenha sido atingido. Incline a placa ligeiramente, para facilitar a pontuação do filme de vedação perfurante pré-cortado, e com o tubo diretamente acima do poço correto, rapidamente, mas cuidadosamente inverter a placa para que a ponta de corte se encaixe no poço. Use uma ferramenta esterilizada para tocar a parte superior do tubo até que todo o solo tenha caído do tubo para o poço.
E deixe o tubo no poço com a chumbo fechada. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas da mesma forma, remova um tubo PCR de tampa plana de 200 microliteres e adicione 750 microliters de solução de contas ao poço da amostra. Coloque o tubo PCR de tampa plana de 200 microliter de volta para o poço empurrando-o todo o caminho para baixo para o poço.
E use uma Sharpie para marcar o topo do tubo para indicar que o poço foi carregado. Quando todos os poços tiverem sido carregados com contas, devolva os tubos de amostra de 24 tubos de amostra para 20 graus Celsius de armazenamento e adicione 24 novos tubos de subamostra ao bloco de gelo, para permitir que o próximo conjunto de amostras seja carregado na placa de 96 poços como apenas demonstrado. Quando todos os 95 poços tiverem sido carregados com solução de amostra e contas, adicione a solução de contas apenas ao 96º poço.
Remova todos os tubos, passando-os apenas sobre poços cobertos e remova cuidadosamente o filme perfurado da placa. Em seguida, transfira cuidadosamente a tampa da placa do saco plástico para a placa e coloque a placa a 20 graus Celsius até a extração planejada. Uma comparação dos métodos de carregamento de placas mostra que o método demonstrado resulta na menor concentração de DNA dentro dos poços em branco.
Usando este método, a concentração de DNA foi significativamente menor do que quando se utilizava o método proposto por McPherson et al. Embora a concentração de DNA por este método não fosse estatisticamente diferente do método padrão qiagen. Todos os três métodos produzem concentrações médias de DNA sob dois nanogramas por microliter.
Embora apenas este novo método produz poços sem concentração de DNA mensurável. Para minimizar o potencial de derramamento, mantenha o tubo de 200 microliter ereto ao movê-lo sobre a placa, incline a placa e insira o tubo no poço correto.
