创伤性脑损伤的神经炎症和血流动力学反应的系统分析

这些方法可用于表征神经炎症和血流动力学对脑损伤的反应，作为使用偏最小二乘回归的多变量系统分析的一部分。这些技术用于提供大脑对损伤反应的整体视图。为了诱导损伤，确认麻醉小鼠对脚趾捏合缺乏反应，并将小鼠置于薄膜中心的俯卧位。

用双手握住所教组织，将鼠标的尾巴固定在拇指下，并将鼠标头定位在导管下方。当鼠标就位时，瞄准眼睛后部和耳朵前部之间的冲击力，将螺栓从导管顶部放到鼠标头部的背侧。撞击时，小鼠将突破组织，允许头部围绕颈部的快速加速。

受伤后，让小鼠在37摄氏度的加热垫上以仰卧位恢复。稳定两分钟后，将DCS传感器轻轻地放在鼠标头骨的右半球上，使光学传感器的顶部边缘与眼睛的后部对齐，传感器的侧面沿着中线对齐。用杯子放在传感器上，以保护其免受室内光线的影响，并获取五秒钟的数据。

然后，将传感器重新定位在左半球，并获取五秒钟的左半球数据。为了评估多重细胞因子和磷酸化蛋白的产生，每收获的动物脑组织约3毫克加入150微升混合裂解缓冲液。并使用1， 000微升移液器吸头对组织进行机械研磨15至20次。

将均质化的样品在4摄氏度下在旋转器上放置30分钟，然后通过离心收集组织碎片。将上清液转移到新管中并离心样品以除去任何剩余的沉淀物。将上清液转移到新管中，并根据标准方案通过BCA测定测定蛋白质浓度。

以新管中的线性范围分析确定的最佳蛋白质浓度制备每个样品的25微升。使用测定缓冲液将每个样品的总体积归一化至25微升。为了制备测定板，向96孔板的每个孔中加入200微升洗涤缓冲液，并在振荡器上以每分钟750转的速度摇动板10分钟。

在孵育结束时，倾析洗涤缓冲液并将板敲击到纸巾上以除去任何残留物。接下来，向每个孔中加入25微升的测定缓冲液，然后向背景孔中加入25微升的缓冲液。将25微升稀释的样品加入适当的样品孔中，并涡旋多路复用磁珠的通孔一分钟，然后向每个孔中加入25微升完全重新悬浮的磁珠。

添加完所有珠子后，用板封口机密封板，并用箔片盖住板，在两到八摄氏度下振荡过夜孵育。第二天早上，将板放在磁选机上，确保孔与磁铁对齐。两分钟后，用仍然附着在磁选机上的板倾析孔内容物，并向每个孔中加入200微升洗涤缓冲液。

保持摇晃两分钟后，将板放在磁选机上两分钟。然后，用仍然附着在磁选机上的板倾析孔内容物，并用每孔200微升的洗涤缓冲液洗涤板，如刚才所示。第二次洗涤后，每孔加入25微升检测抗体，并用箔重新覆盖，在室温下以每分钟750转的速度孵育一小时。

在孵育结束时，向每个孔中加入25微升链霉亲和素藻红素，并将板返回到振荡器中，在室温下再放置30分钟。在孵育结束时，将板放在磁选机上两分钟，然后倾析孔内容物。每次洗涤用200微升新鲜洗涤缓冲液洗涤板两次，并向每个孔中加入75微升适当的驱动液。

然后，在室温下将磁珠重新悬浮在平板振荡器上五分钟，并根据制造商的说明在分析仪上读取板。在该分析中，在最后一次损伤后四小时用弥漫相关光谱测量脑血流量。然后可以确定每个半球的脑血流量指数和平均脑流量指数。

在从所有样品收集数据之前，可以进行线性范围分析以确定适当的蛋白质上样质量。可以通过从样品数据中减去背景测量值，然后计算每种阳极解质的Z评分数据来制备细胞因子数据。部分最小二乘回归可以通过使用吞噬细胞小胶质细胞活化标记或其他感兴趣的变量作为响应变量，并将细胞因子测量作为预测变量来进行。

可以执行Varimax旋转，以最大化潜在变量1上数据的协方差，并进行激活标记测量。潜伏变量1中的高负载权重对应于与活化标记物的高表达最相关的细胞因子表达。活化标志物和细胞因子之间的线性回归表明，在潜伏变量1中具有最大负载权重的细胞因子对于该分析也具有统计学意义。

虽然我们把这个方案集中在创伤性脑损伤上，但这些方法被广泛推广到影响大脑的大量病理状况的研究上。我们使用这些技术来帮助我们确定可处理的靶点，以便在未来的实验中进行调节，以建立因果机制关系，并最终开发针对轻度创伤性脑损伤的新治疗策略。