Ces méthodes peuvent être utilisées pour caractériser les réponses neuro-inflammatoires et hémodynamiques aux lésions cérébrales dans le cadre d’une analyse multivariée du système utilisant la régression partielle des moindres carrés. Ces techniques sont utilisées pour donner une vision plus holistique de la réponse du cerveau aux blessures. Pour induire une blessure, confirmez un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris anesthésiée et placez la souris en position couchée au centre d’une membrane mince.
En utilisant les deux mains pour tenir le tissu enseigné, fixez la queue de la souris sous un pouce et positionnez-la sur la tête de la souris sous le tube guide. Lorsque la souris est en position, visant l’impact entre l’arrière des yeux et l’avant des oreilles, déposez le boulon du haut du tube guide sur l’aspect dorsal de la tête de la souris. Lors de l’impact, la souris percera le tissu, permettant une accélération rapide de la tête autour du cou.
Après la blessure, laissez la souris récupérer en position couchée sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius. Après une période de stabilisation de deux minutes, placez doucement le capteur DCS sur l’hémisphère droit du crâne de la souris, de sorte que le bord supérieur du capteur optique s’aligne avec l’arrière de l’œil et le côté du capteur s’aligne le long de la ligne médiane. Passez une main sur le capteur pour le protéger de la lumière ambiante et acquérir cinq secondes de données.
Ensuite, repositionnez le capteur sur l’hémisphère gauche et acquérez cinq secondes de données de l’hémisphère gauche. Pour évaluer la production multiplexée de cytokines et de phosphoprotéines, ajoutez 150 microlitres de tampon de lyse mixte pour environ trois milligrammes de tissu cérébral animal récolté. Et utilisez une pointe de pipette de 1 000 microlitres pour triturer mécaniquement le tissu 15 à 20 fois.
Placer les échantillons homogénéisés sur un rotateur pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avant de prélever les débris tissulaires par centrifugation. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes et centrifuger les échantillons pour éliminer tout précipité restant. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes et déterminer la concentration en protéines par dosage BCA selon des protocoles standard.
Préparer 25 microlitres de chaque échantillon à la concentration optimale en protéines déterminée par l’analyse de la gamme linéaire dans de nouveaux tubes. Utilisation d’un tampon d’essai pour normaliser le volume total de chaque échantillon à 25 microlitres. Pour préparer une plaque d’essai, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage à chaque puits d’une plaque de 96 puits et secouez la plaque sur un agitateur pendant 10 minutes à 750 tours par minute.
À la fin de l’incubation, décantez le tampon de lavage et tapotez la plaque sur une serviette en papier pour éliminer tout résidu. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon d’essai à chaque puits, suivis de 25 microlitres supplémentaires de tampon aux puits de fond. Ajouter 25 microlitres d’échantillons dilués aux puits d’échantillonnage appropriés et faire passer par tourbillon de billes magnétiques multiplexées pendant une minute, avant d’ajouter 25 microlitres de perles soigneusement remises en suspension à chaque puits.
Lorsque toutes les perles ont été ajoutées, scellez la plaque avec un scellant à plaques et recouvrez la plaque de papier d’aluminium pour une incubation nocturne avec agitation à deux à huit degrés Celsius. Le lendemain matin, placez la plaque sur un séparateur magnétique, en vous assurant que les puits sont alignés avec les aimants. Après deux minutes, décantez le contenu du puits avec la plaque encore attachée au séparateur magnétique et ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage à chaque puits.
Après l’avoir fait trembler pendant deux minutes, placez la plaque sur le séparateur magnétique pendant deux minutes. Ensuite, décantez le contenu du puits avec la plaque toujours attachée au séparateur magnétique et lavez la plaque avec un tampon de lavage frais de 200 microlitres par puits, comme cela vient d’être démontré. Après le deuxième lavage, ajoutez 25 microlitres d’anticorps de détection par puits et recouvrez à nouveau de papier d’aluminium pour une incubation d’une heure à 750 tours par minute à température ambiante.
À la fin de l’incubation, ajouter 25 microlitres de streptavidine phycoérythrine à chaque puits et remettre la plaque dans le shaker pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. À la fin de l’incubation, placez la plaque sur le séparateur magnétique pendant deux minutes avant de décanter le contenu du puits. Lavez la plaque deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage frais par lavage et ajoutez 75 microlitres du fluide d’entraînement approprié à chaque puits.
Ensuite, remettez les billes sur le shaker à plaque pendant cinq minutes à température ambiante et lisez les plaques sur l’analyseur conformément aux instructions du fabricant. Dans cette analyse, le débit sanguin cérébral a été mesuré par spectroscopie de corrélation diffuse quatre heures après la dernière blessure. L’indice de flux sanguin cérébral et l’indice de flux cérébral moyen pour chaque hémisphère peuvent ensuite être déterminés.
Une analyse linéaire de l’aire de répartition peut être effectuée pour déterminer une masse de charge protéique appropriée avant de recueillir des données à partir de tous les échantillons. Les données sur les cytokines peuvent être préparées en soustrayant les mesures de fond des données de l’échantillon, puis en calculant les données Z-score pour chaque anolyte. La régression partielle des moindres carrés peut être réalisée en utilisant un marqueur d’activation microgliale phagocytaire ou une autre variable d’intérêt comme variable de réponse, et les mesures de cytokines comme variables prédictives.
La rotation Varimax peut être effectuée pour maximiser la covariance des données sur la variable latente un, avec les mesures du marqueur d’activation. Les poids de charge élevés dans la variable latente un correspondent aux expressions de cytokines les plus associées à une expression élevée du marqueur d’activation. Les régressions linéaires entre le marqueur d’activation et les cytokines montrent que les cytokines ayant les poids de charge les plus élevés dans la variable latente un étaient également statistiquement significatives pour cette analyse.
Bien que nous ayons axé ce protocole sur les lésions cérébrales traumatiques, ces méthodes sont largement généralisables à l’étude d’une pléthore de conditions pathologiques qui affectent le cerveau. Nous utilisons ces techniques pour nous aider à identifier des cibles traitables à moduler dans de futures expériences afin d’établir des relations mécanistes causales et, en fin de compte, dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les lésions cérébrales traumatiques légères.
