يمكن استخدام هذه الطرق لتوصيف الاستجابات العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية لإصابات الدماغ كجزء من تحليل النظام متعدد المتغيرات باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى. تستخدم هذه التقنيات لإعطاء نظرة أكثر شمولية لاستجابة الدماغ للإصابة. للحث على حدوث إصابة ، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم في فأر مخدر وضع الماوس في وضع الانبطاح في وسط غشاء رقيق.
باستخدام كلتا اليدين لحمل الأنسجة التي تم تدريسها ، قم بتأمين ذيل الماوس تحت الإبهام ووضعه على رأس الماوس تحت أنبوب التوجيه. عندما يكون الماوس في موضعه ، بهدف التأثير بين الجزء الخلفي من العينين والجزء الأمامي من الأذنين ، قم بإسقاط الترباس من أعلى أنبوب التوجيه على الجانب الظهري لرأس الماوس. عند الاصطدام ، سوف يخترق الماوس الأنسجة ، مما يسمح بالتسارع السريع للرأس حول الرقبة.
بعد الإصابة ، اسمح للفأر بالتعافي في وضع الاستلقاء على وسادة تسخين 37 درجة مئوية. بعد فترة من الاستقرار لمدة دقيقتين، ضع مستشعر DCS برفق فوق نصف الكرة الأيمن من جمجمة الماوس، بحيث تصطف الحافة العلوية للمستشعر البصري مع الجزء الخلفي من العين ويصطف جانب المستشعر على طول خط الوسط. ضع يده على المستشعر لحمايته من ضوء الغرفة والحصول على خمس ثوان من البيانات.
ثم قم بتغيير موضع المستشعر فوق نصف الكرة الأيسر واحصل على خمس ثوان من بيانات نصف الكرة الأيسر. لتقييم إنتاج السيتوكين وبروتين الفوسفو متعدد الإرسال ، أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المختلط لكل حوالي ثلاثة ملليغرام من أنسجة المخ الحيوانية التي تم حصادها. واستخدم طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتثليث الأنسجة ميكانيكيا من 15 إلى 20 مرة.
ضع العينات المتجانسة على دوار لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية قبل جمع حطام الأنسجة عن طريق الطرد المركزي. نقل المواد الفائقة إلى أنابيب جديدة وطرد مركزي للعينات لإزالة أي راسب متبقي. نقل المواد الفائقة إلى أنابيب جديدة وتحديد تركيز البروتين عن طريق فحص BCA وفقا للبروتوكولات القياسية.
تحضير 25 ميكرولتر من كل عينة عند تركيز البروتين الأمثل كما هو محدد من خلال تحليل المدى الخطي في الأنابيب الجديدة. استخدام المخزن المؤقت للفحص لتطبيع الحجم الإجمالي لكل عينة إلى 25 ميكرولتر. لإعداد لوحة فحص ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا وهز الطبق على شاكر لمدة 10 دقائق بمعدل 750 دورة في الدقيقة.
في نهاية الحضانة ، قم بصب المخزن المؤقت للغسيل واضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة أي بقايا. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى كل بئر ، متبوعا ب 25 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت إلى الآبار الخلفية. أضف 25 ميكرولترا من العينات المخففة إلى آبار العينات المناسبة ودوامة الخرز المغناطيسي متعدد الإرسال لمدة دقيقة واحدة ، قبل إضافة 25 ميكرولتر من الخرز المعاد تعليقه تماما إلى كل بئر.
عند إضافة جميع الخرز ، قم بإغلاق اللوحة بسدادة لوحة وقم بتغطية اللوحة بورق القصدير لحضانة بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، ضع اللوحة على فاصل مغناطيسي ، مع التأكد من محاذاة الآبار مع المغناطيس. بعد دقيقتين ، قم بصب محتويات البئر مع اللوحة التي لا تزال متصلة بالفاصل المغناطيسي وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر.
بعد إبقائها تهتز لمدة دقيقتين ، ضع اللوحة على الفاصل المغناطيسي لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بصب محتويات البئر مع اللوحة التي لا تزال متصلة بالفاصل المغناطيسي واغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل بئر ، كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الثاني ، أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف لكل بئر وأعد تغطيتها بورق القصدير لمدة ساعة واحدة عند 750 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، أضف 25 ميكرولتر من الستربتافيدين فيكويريثرين إلى كل بئر وأعد اللوحة إلى الخلاط لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، ضع اللوحة على الفاصل المغناطيسي لمدة دقيقتين قبل صب محتويات البئر. اغسل الطبق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل الطازج لكل غسلة وأضف 75 ميكرولتر من سائل القيادة المناسب إلى كل بئر.
ثم ، أعد تعليق الخرز على شاكر اللوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة واقرأ الألواح الموجودة على المحلل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في هذا التحليل ، تم قياس تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي المنتشر للارتباط بعد أربع ساعات من الإصابة الأخيرة. يمكن بعد ذلك تحديد مؤشر تدفق الدم الدماغي ومؤشر متوسط التدفق الدماغي لكل نصف الكرة الأرضية.
يمكن إجراء تحليل النطاق الخطي لتحديد كتلة تحميل البروتين المناسبة قبل جمع البيانات من جميع العينات. يمكن تحضير بيانات السيتوكين عن طريق طرح قياسات الخلفية من بيانات العينة ، ثم حساب بيانات Z-score لكل أنوليت. يمكن إجراء الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى باستخدام علامة تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة للخلايا البلعمية أو متغير آخر ذي أهمية كمتغير استجابة ، وقياسات السيتوكين كمتغيرات تنبؤية.
يمكن إجراء دوران Varimax لزيادة التباين المشترك للبيانات على المتغير الكامن الأول ، مع قياسات علامة التنشيط. تتوافق أوزان التحميل العالية في المتغير الكامن مع تعبيرات السيتوكين الأكثر ارتباطا بالتعبير العالي لعلامة التنشيط. توضح الانحدارات الخطية بين علامة التنشيط والسيتوكينات أن تلك السيتوكينات ذات الأوزان الأكبر للتحميل في المتغير الكامن الأول كانت أيضا ذات دلالة إحصائية لهذا التحليل.
على الرغم من أننا ركزنا هذا البروتوكول على إصابات الدماغ الرضحية ، إلا أن هذه الطرق قابلة للتعميم على نطاق واسع لدراسة عدد كبير من الحالات المرضية التي تؤثر على الدماغ. نحن نستخدم هذه التقنيات لمساعدتنا على تحديد أهداف قابلة للسحب لتعديلها في التجارب المستقبلية لإنشاء علاقات ميكانيكية سببية وفي النهاية بهدف تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة.
