שיטות אלה יכולות לשמש לאפיון תגובות נוירו-דלקתיות והמודינמיות לפגיעה מוחית כחלק מניתוח מערכת רב-משתני באמצעות רגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים. טכניקות אלה משמשות כדי לתת יותר מבט הוליסטי על תגובת המוח לפציעה. כדי לגרום לפציעה, ודא חוסר תגובה לצביטת הבוהן בעכבר מורדם והנח את העכבר במצב נוטה במרכז קרום דק.
באמצעות שתי הידיים כדי להחזיק את הרקמה הנלמדת, מהדק את זנב העכבר מתחת לאגודל וממקם את ראש העכבר מתחת לצינור ההנחיה. כאשר העכבר נמצא במקומו, מכוון לפגיעה בין החלק האחורי של העיניים לחזית האוזניים, שחררו את הבריח מהחלק העליון של צינור ההנחיה אל ההיבט הגבי של ראש העכבר. עם הפגיעה, העכבר יפרוץ דרך הרקמה, מה שיאפשר האצה מהירה של הראש סביב הצוואר.
לאחר הפציעה, אפשרו לעכבר להתאושש במצב שכיבה על משטח התחממות של 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן של שתי דקות של ייצוב, הניחו בעדינות את חיישן ה-DCS מעל ההמיספרה הימנית של גולגולת העכבר, כך שהקצה העליון של החיישן האופטי יתיישר עם החלק האחורי של העין וצד החיישן יתיישרו לאורך קו האמצע. העבירו יד על החיישן כדי להגן עליו מפני אור החדר וקבלו חמש שניות של נתונים.
לאחר מכן, מקם מחדש את החיישן מעל ההמיספרה השמאלית וקבל חמש שניות של נתוני המיספרה השמאלית. כדי להעריך את ייצור הציטוקינים והפוטו-חלבונים המרובים, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של מאגר ליזה מעורבת לכל כשלושה מיליגרם של רקמת מוח של בעלי חיים שנקטפו. והשתמשו בקצה פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לפענח את הרקמה באופן מכני 15 עד 20 פעמים.
מניחים את הדגימות ההומוגניות על מסובב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני איסוף פסולת הרקמה על ידי צנטריפוגה. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים וצנטריפוגות בדגימות כדי להסיר את כל המשקעים שנותרו. מעבירים את הסופרנאטים לצינורות חדשים וקובעים את ריכוז החלבון על ידי בדיקת BCA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
הכינו 25 מיקרוליטרים של כל דגימה בריכוז החלבון האופטימלי כפי שנקבע על ידי ניתוח הטווח הליניארי בצינורות חדשים. שימוש במאגר בדיקה כדי לנרמל את הנפח הכולל של כל דגימה ל-25 מיקרוליטרים. כדי להכין צלחת בדיקה, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה לכל באר של צלחת של 96 בארות וניערו את הצלחת על שייקר במשך 10 דקות במהירות של 750 סיבובים לדקה.
בסוף הדגירה, הורידו את חיץ הכביסה והקשו על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר שאריות. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה לכל באר, ולאחר מכן 25 מיקרוליטרים נוספים של חיץ לבארות הרקע. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של הדגימות המדוללות לבארות הדגימה המתאימות והתפתלו באמצעות חרוזים מגנטיים מרובבים למשך דקה אחת, לפני שתוסיפו 25 מיקרוליטרים של החרוזים התלויים מחדש ביסודיות לכל באר.
לאחר הוספת כל החרוזים, אטמו את הצלחת באיטום צלחת וכיסו את הצלחת בנייר כסף לדגירה לילית עם רעד בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, הניחו את הצלחת על מפריד מגנטי, וודאו שהבארות מיושרות עם המגנטים. לאחר שתי דקות, נקו את תכולת הבאר כשהצלחת עדיין מחוברת למפריד המגנטי והוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה לכל באר.
לאחר שהשארתם רועדת במשך שתי דקות, הניחו את הצלחת על המפריד המגנטי למשך שתי דקות. לאחר מכן, נקו את תכולת הבאר כשהצלחת עדיין מחוברת למפריד המגנטי ושטפו את הצלחת עם 200 מיקרוליטרים טריים של חיץ שטיפה לכל באר, כפי שהדגימו זה עתה. לאחר הדחיפה השנייה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של נוגדני זיהוי לכל באר וכיסוי מחדש בנייר כסף לצורך דגירה של שעה אחת במהירות של 750 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, מוסיפים 25 מיקרוליטרים סטרפטווידין פיקואריתרין לכל באר ומחזירים את הצלחת לשייקר למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הצלחת על המפריד המגנטי למשך שתי דקות לפני פירוק תכולת הבאר. שטפו את הצלחת פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של חיץ כביסה טרי לכל שטיפה והוסיפו 75 מיקרוליטרים של נוזל ההנעה המתאים לכל באר.
לאחר מכן, להשעות מחדש את החרוזים על שייקר הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולקרוא את הצלחות על המנתח על פי הוראות היצרן. בניתוח זה נמדדה זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר ארבע שעות לאחר הפציעה האחרונה. לאחר מכן ניתן לקבוע את מדד זרימת הדם המוחית המוחית ואת מדד הזרימה המוחית הממוצעת עבור כל חצי כדור.
ניתן לבצע ניתוח טווח ליניארי כדי לקבוע מסת טעינת חלבון מתאימה לפני איסוף נתונים מכל הדגימות. ניתן להכין נתוני ציטוקינים על ידי הפחתת מדידות הרקע מנתוני המדגם, ולאחר מכן חישוב נתוני ציון Z עבור כל אנוליט. ניתן לבצע רגרסיה של ריבועים מזעריים חלקיים על ידי שימוש בסמן הפעלה מיקרוגליאלי של פאגוציטים או במשתנה עניין אחר כמשתנה התגובה, ומדידות הציטוקינים כמשתנים המנבאים.
ניתן לבצע סיבוב Varimax כדי למקסם את השונות המשותפת של הנתונים על משתנה סמוי אחד, עם מדידות סמן ההפעלה. משקלי העמסה גבוהים במשתנה סמוי תואמים את ביטויי הציטוקינים הקשורים ביותר לביטוי גבוה של סמן ההפעלה. רגרסיות ליניאריות בין סמן ההפעלה לציטוקינים ממחישות כי אותם ציטוקינים עם משקלי ההעמסה הגדולים ביותר במשתנה הסמוי היו גם מובהקים סטטיסטית לניתוח זה.
למרות שמיקדנו את הפרוטוקול הזה בפגיעה מוחית טראומטית, שיטות אלה ניתנות להכללה נרחבת לחקר שפע של מצבים פתולוגיים המשפיעים על המוח. אנו משתמשים בטכניקות אלה כדי לעזור לנו לזהות מטרות הניתנות לוויסות בניסויים עתידיים כדי ליצור קשרים מכניסטיים סיבתיים ובסופו של דבר במטרה לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לפגיעה מוחית טראומטית קלה.
