Bu yöntemler, kısmi en küçük kareler regresyonu kullanılarak çok değişkenli bir sistem analizinin bir parçası olarak beyin hasarına nöroinflamatuar ve hemodinamik yanıtları karakterize etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, beynin yaralanmaya verdiği tepkinin bütünsel bir görünümünü vermek için kullanılır. Bir yaralanmaya neden olmak için, anestezi uygulanmış bir farede ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğrulayın ve fareyi ince bir zarın ortasındaki yüzüstü pozisyona yerleştirin.
Öğretilen dokuyu tutmak için her iki elinizi kullanarak, farenin kuyruğunu bir başparmağın altına sabitleyin ve kılavuz tüpün altındaki fare kafasına yerleştirin. Fare konumdayken, gözlerin arkası ile kulakların önü arasındaki darbeyi hedefleyerek, cıvatayı kılavuz tüpün üstünden farenin başının sırt kısmına bırakın. Çarpma üzerine, fare dokuyu kıracak ve başın boyun etrafında hızlı bir şekilde hızlanmasına izin verecektir.
Yaralanmadan sonra, farenin 37 santigrat derecelik bir ısıtma pedi üzerinde sırtüstü pozisyonda iyileşmesine izin verin. İki dakikalık bir stabilizasyon süresinden sonra, DCS sensörünü farenin kafatasının sağ yarımküresi üzerinde yavaşça dinlendirin, böylece optik sensörün üst kenarı gözün arkasıyla hizalanır ve sensörün tarafı orta hat boyunca hizalanır. Oda ışığından korumak ve beş saniyelik veri elde etmek için sensörün üzerine bir el koyun.
Ardından, sensörü sol yarımküre üzerinde yeniden konumlandırın ve beş saniyelik sol yarımküre verilerini alın. Çoklanmış sitokin ve fosfo-protein üretimini değerlendirmek için, yaklaşık üç miligram hasat edilmiş hayvan beyin dokusu başına 150 mikrolitre karışık lizis tamponu ekleyin. Ve dokuyu 15 ila 20 kez mekanik olarak tritüre etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.
Homojenize edilmiş numuneleri, santrifüjleme yoluyla doku kalıntılarını toplamadan önce dört santigrat derecede 30 dakika boyunca bir rotatöre yerleştirin. Süpernatantları yeni tüplere aktarın ve kalan çökeltiyi çıkarmak için numuneleri santrifüj edin. Süpernatantları yeni tüplere aktarın ve standart protokollere göre BCA testi ile protein konsantrasyonunu belirleyin.
Her numunenin 25 mikrolitresini, yeni tüplerdeki doğrusal aralık analizi ile belirlenen optimum protein konsantrasyonunda hazırlayın. Her numunenin toplam hacmini 25 mikrolitreye normalleştirmek için tahlil tamponu kullanmak. Bir tahlil plakası hazırlamak için, 96 delikli bir plakanın her bir oluğuna 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve plakayı dakikada 750 devirde 10 dakika çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
Kuluçkanın sonunda, yıkama tamponunu boşaltın ve herhangi bir kalıntıyı gidermek için plakayı bir kağıt havluya dokunun. Daha sonra, her bir kuyucuğa 25 mikrolitre tahlil tamponu, ardından arka plan kuyularına 25 mikrolitre ilave tampon ekleyin. Seyreltilmiş numunelerin 25 mikrolitresini uygun numune kuyularına ekleyin ve her bir kuyucuğa iyice yeniden askıya alınmış boncukların 25 mikrolitresini eklemeden önce bir dakika boyunca çoklanmış manyetik boncukların içinden vorteks yapın.
Tüm boncuklar eklendiğinde, plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın ve iki ila sekiz santigrat derecede sallanarak bir gece inkübasyonu için plakayı folyo ile örtün. Ertesi sabah, plakayı manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve kuyucukların mıknatıslarla hizalandığından emin olun. İki dakika sonra, kuyu içeriğini plaka hala manyetik ayırıcıya bağlı olacak şekilde boşaltın ve her bir kuyucuğa 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.
İki dakika boyunca sallanmasını sağladıktan sonra, plakayı iki dakika boyunca manyetik ayırıcıya yerleştirin. Daha sonra, kuyu içeriğini plaka hala manyetik ayırıcıya bağlı olarak boşaltın ve plakayı, az önce gösterildiği gibi, kuyu başına taze bir 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, kuyucuk başına 25 mikrolitre algılama antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında dakikada 750 devirde bir saatlik inkübasyon için folyo ile tekrar örtün.
Kuluçkanın sonunda, her bir oyuğa 25 mikrolitre streptavidin fikoeritrin ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika daha çalkalayıcıya geri koyun. Kuluçkanın sonunda, kuyu içeriğini boşaltmadan önce plakayı iki dakika boyunca manyetik ayırıcıya yerleştirin. Plakayı yıkama başına 200 mikrolitre taze yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve her bir oyuğa 75 mikrolitre uygun tahrik sıvısı ekleyin.
Ardından, plaka çalkalayıcıdaki boncukları oda sıcaklığında beş dakika boyunca tekrar askıya alın ve analizördeki plakaları üreticinin talimatlarına göre okuyun. Bu analizde, serebral kan akımı, son yaralanmadan dört saat sonra diffüz korelasyon spektroskopisi ile ölçüldü. Her yarım küre için serebral kan akış indeksi ve ortalama serebral akış indeksi daha sonra belirlenebilir.
Tüm numunelerden veri toplamadan önce uygun bir protein yükleme kütlesini belirlemek için doğrusal bir aralık analizi yapılabilir. Sitokin verileri, örnek verilerden arka plan ölçümleri çıkarılarak ve ardından her anolit için Z-skoru verileri hesaplanarak hazırlanabilir. Kısmi en küçük kareler regresyonu, yanıt değişkeni olarak bir fagosit mikroglial aktivasyon belirteci veya başka bir ilgili değişken ve öngörücü değişkenler olarak sitokin ölçümleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Varimax rotasyonu, aktivasyon işaretleyici ölçümleri ile gizli değişken birdeki verilerin kovaryansını en üst düzeye çıkarmak için gerçekleştirilebilir. Gizli değişken olandaki yüksek yükleme ağırlıkları, aktivasyon belirtecinin yüksek ekspresyonu ile en çok ilişkili sitokin ifadelerine karşılık gelir. Aktivasyon belirteci ve sitokinler arasındaki doğrusal regresyonlar, gizli değişken birinde en büyük yükleme ağırlığına sahip sitokinlerin de bu analiz için istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir.
Bu protokolü travmatik beyin hasarına odaklamamıza rağmen, bu yöntemler beyni etkileyen çok sayıda patolojik durumun incelenmesine yaygın olarak genellenebilir. Bu teknikleri, nedensel mekanik ilişkiler kurmak için gelecekteki deneylerde modüle etmek için ve nihayetinde hafif travmatik beyin hasarı için yeni terapötik stratejiler geliştirmek amacıyla izlenebilir hedefleri belirlememize yardımcı olmak için kullanıyoruz.
