これらの方法は、部分最小二乗回帰を用いた多変量系解析の一部として、脳損傷に対する神経炎症性および血行動態応答を特徴付けるために使用することができる。これらの技術は、傷害に対する脳の反応の全体像をより多く示すために使用されます。怪我を誘発するには、麻酔をかけられたマウスでつま先のピンチに対する反応の欠如を確認し、マウスを薄い膜の中心の傾向がある位置に置きます。
両手で教えた組織を持ち、マウスの尾を親指の下に固定し、マウスの頭をガイドチューブの下に置きます。マウスが所定の位置に収まったら、目の後ろと耳の前の衝撃を狙って、ガイドチューブの上部からマウスの頭の背側の側面にボルトを落とします。衝撃を受けると、マウスは組織を突き破り、首の周りの頭の急速な加速を可能にします。
怪我をした後、マウスが摂氏37度の温暖化パッドの仰臥位で回復するのを許します。2分間の安定化の後、DCSセンサーをマウスの頭蓋骨の右半球にそっと置き、光学センサーの上端が目の後ろと並び、センサーの側面が正中線に沿って並ぶようにします。センサーに手をかざして部屋の光から遮蔽し、5秒間のデータを取得します。
次に、センサーを左半球の上に再配置し、5秒間の左半球データを取得します。多重化されたサイトカインおよびリンタンパク質産生を評価するために、採取した動物の脳組織の約3ミリグラムあたり150マイクロリットルの混合溶解緩衝液を加える。1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、組織を機械的に15〜20回粉砕する。
均質化されたサンプルを摂氏4度で30分間回転子上に置き、遠心分離によって組織破片を収集する。上清を新しいチューブに移し、サンプルを遠心分離して残りの沈殿物を除去します。上清を新しいチューブに移し、標準的なプロトコールに従ってBCAアッセイによってタンパク質濃度を決定する。
新しいチューブ内の線形範囲分析によって決定された最適なタンパク質濃度で各サンプルの25マイクロリットルを調製する。アッセイバッファーを用いて、各サンプルの総体積を25マイクロリットルに正規化した。アッセイプレートを調製するために、96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加し、プレートをシェーカー上で毎分750回転で10分間振盪する。
インキュベーションの最後に、洗浄バッファーをデカントし、プレートをペーパータオルに叩きつけて残留物を取り除きます。次に、各ウェルに25マイクロリットルのアッセイバッファーを添加し、続いてバックグラウンドウェルに25マイクロリットルのバッファーを追加します。希釈したサンプル25マイクロリットルを適切なサンプルウェルに加え、多重化された磁気ビーズのビアを1分間渦巻きしてから、25マイクロリットルの完全に再懸濁したビーズを各ウェルに加える。
すべてのビーズが添加されたら、プレートシーラーでプレートを密封し、プレートをホイルで覆い、摂氏2〜8度で振とうしながら一晩インキュベーションします。翌朝、プレートを磁気分離器の上に置き、井戸が磁石と揃っていることを確認します。2分後、プレートを磁気分離器に取り付けたままウェルの内容物をデカントし、各ウェルに200マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。
2分間振盪した後、プレートを磁気セパレータの上に2分間置きます。次に、磁気分離器に取り付けられたままのプレートでウェルの内容物をデカントし、先ほど実証したように、ウェルあたり新鮮な200マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを洗浄します。2回目の洗浄後、ウェルあたり25マイクロリットルの検出抗体を添加し、ホイルで再カバーし、室温で毎分750回転で1時間インキュベーションした。
インキュベーションの終わりに、25マイクロリットルのストレプトアビジンフィコエリスリンを各ウェルに加え、プレートを室温でさらに30分間振とう機に戻した。インキュベーションの最後に、プレートを磁気分離器の上に2分間置いてから、ウェルの内容物をデカントします。洗浄ごとに200マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーでプレートを2回洗浄し、75マイクロリットルの適切な駆動液を各ウェルに加えます。
その後、ビーズをプレートシェーカーに再懸濁し、室温で5分間、製造元の指示に従って分析装置上のプレートを読み取った。この分析では、脳血流を、最後の傷害の4時間後にびまん性相関分光法で測定した。次いで、各半球の脳血流指数および平均脳流指数を決定することができる。
すべてのサンプルからデータを収集する前に、適切なタンパク質負荷量を決定するために線形範囲分析を実施することができます。サイトカインデータは、サンプルデータからバックグラウンド測定値を差し引いてから、各陽極液のZスコアデータを計算することによって調製することができる。偏最小二乗回帰は、応答変数として貪食細胞ミクログリア活性化マーカーまたは他の関心のある変数を使用し、サイトカイン測定値を予測変数として使用することによって行うことができる。
バリマックス回転は、活性化マーカー測定を用いて、潜在変数1上のデータの共分散を最大化するために実行することができる。潜在変数1における高負荷重みは、活性化マーカーの高発現に最も関連するサイトカイン発現に対応する。活性化マーカーとサイトカインとの間の線形回帰は、潜在変数1において最大の負荷重みを有するサイトカインもまた、この分析において統計的に有意であったことを示す。
我々はこのプロトコルを外傷性脳損傷に焦点を合わせたが、これらの方法は、脳に影響を及ぼす多数の病理学的状態の研究に広く一般化可能である。これらの技術を使用して、将来の実験で調節する扱いやすい標的を特定し、因果関係の機械的関係を確立し、最終的には軽度の外傷性脳損傷に対する新しい治療戦略を開発することを目標としています。
