Questi metodi possono essere utilizzati per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie ed emodinamiche alle lesioni cerebrali come parte di un'analisi del sistema multivariato utilizzando la regressione parziale dei minimi quadrati. Queste tecniche sono utilizzate per dare più di una visione olistica della risposta del cervello alle lesioni. Per indurre una lesione, confermare una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita in un topo anestetizzato e posizionare il mouse in posizione prona al centro di una membrana sottile.
Usando entrambe le mani per tenere il tessuto insegnato, fissare la coda del mouse sotto un pollice e posizionare la testa del mouse sotto il tubo guida. Quando il mouse è in posizione, mirando all'impatto tra la parte posteriore degli occhi e la parte anteriore delle orecchie, far cadere il bullone dalla parte superiore del tubo guida sull'aspetto dorsale della testa del topo. All'impatto, il topo sfonderà il tessuto, consentendo una rapida accelerazione della testa intorno al collo.
Dopo l'infortunio, consentire al mouse di recuperare in posizione supina su un cuscinetto riscaldante a 37 gradi Celsius. Dopo un periodo di stabilizzazione di due minuti, appoggiare delicatamente il sensore DCS sull'emisfero destro del cranio del mouse, in modo che il bordo superiore del sensore ottico si allinei con la parte posteriore dell'occhio e il lato del sensore si allinei lungo la linea mediana. Metti una mano sopra il sensore per proteggerlo dalla luce della stanza e acquisire cinque secondi di dati.
Quindi, riposiziona il sensore sull'emisfero sinistro e acquisisci cinque secondi di dati dell'emisfero sinistro. Per valutare la produzione di citochine multiplexate e fosfoproteine, aggiungere 150 microlitri di tampone di lisi mista per circa tre milligrammi di tessuto cerebrale animale raccolto. E utilizzare una punta della pipetta da 1.000 microlitri per triturare meccanicamente il tessuto da 15 a 20 volte.
Posizionare i campioni omogeneizzati su un rotatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius prima di raccogliere i detriti tissutali mediante centrifugazione. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi e centrifugare i campioni per rimuovere il precipitato rimanente. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi e determinare la concentrazione proteica mediante test BCA secondo protocolli standard.
Preparare 25 microlitri di ciascun campione alla concentrazione proteica ottimale determinata dall'analisi lineare del range in nuovi tubi. Utilizzo del buffer di analisi per normalizzare il volume totale di ciascun campione a 25 microlitri. Per preparare una piastra di dosaggio, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e agitare la piastra su uno shaker per 10 minuti a 750 giri al minuto.
Alla fine dell'incubazione, decantare il tampone di lavaggio e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali residui. Quindi, aggiungere 25 microlitri di tampone di saggio a ciascun pozzetto, seguiti da 25 microlitri aggiuntivi di buffer ai pozzetti di fondo. Aggiungere 25 microlitri dei campioni diluiti ai pozzetti campione appropriati e ruotare la via di perline magnetiche multiplexate per un minuto, prima di aggiungere 25 microlitri delle perline completamente rispense a ciascun pozzetto.
Quando tutte le perline sono state aggiunte, sigillare la piastra con un sigillante a piastre e coprire la piastra con un foglio per un'incubazione notturna con agitazione da due a otto gradi Celsius. La mattina dopo, posizionare la piastra su un separatore magnetico, assicurandosi che i pozzetti siano allineati con i magneti. Dopo due minuti, decantare il contenuto del pozzo con la piastra ancora attaccata al separatore magnetico e aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.
Dopo averlo tenuto agitato per due minuti, posizionare la piastra sul separatore magnetico per due minuti. Quindi, decantare il contenuto del pozzo con la piastra ancora attaccata al separatore magnetico e lavare la piastra con un nuovo tampone di lavaggio da 200 microlitri per pozzetto, come appena dimostrato. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 25 microlitri di anticorpi di rilevamento per pozzetto e ricoprire nuovamente con un foglio per un'incubazione di un'ora a 750 giri al minuto a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere 25 microlitri streptavidin phycoerythrin a ciascun pozzetto e restituire la piastra allo shaker per altri 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra sul separatore magnetico per due minuti prima di decantare il contenuto del pozzo. Lavare la piastra due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio e aggiungere 75 microlitri del fluido di azionamento appropriato a ciascun pozzetto.
Quindi, sospendere nuovamente le perline sullo shaker a piastre per cinque minuti a temperatura ambiente e leggere le piastre sull'analizzatore secondo le istruzioni del produttore. In questa analisi, il flusso sanguigno cerebrale è stato misurato con spettroscopia di correlazione diffusa quattro ore dopo l'ultima lesione. L'indice del flusso sanguigno cerebrale e l'indice medio del flusso cerebrale per ciascun emisfero possono quindi essere determinati.
È possibile condurre un'analisi lineare dell'intervallo per determinare una massa di carico proteica appropriata prima di raccogliere dati da tutti i campioni. I dati delle citochine possono essere preparati sottraendo le misurazioni di fondo dai dati del campione, quindi calcolando i dati Z-score per ciascun anolita. La regressione parziale dei minimi quadrati può essere condotta utilizzando un marcatore di attivazione microgliale dei fagociti o un'altra variabile di interesse come variabile di risposta e le misurazioni delle citochine come variabili predittive.
La rotazione Varimax può essere eseguita per massimizzare la covarianza dei dati sulla variabile latente uno, con le misurazioni del marcatore di attivazione. Alti pesi di carico nella variabile latente uno corrispondono alle espressioni delle citochine più associate all'alta espressione del marcatore di attivazione. Le regressioni lineari tra il marcatore di attivazione e le citochine illustrano che le citochine con i maggiori pesi di carico nella variabile latente uno erano anche statisticamente significative per questa analisi.
Sebbene abbiamo focalizzato questo protocollo sulla lesione cerebrale traumatica, questi metodi sono ampiamente generalizzabili allo studio di una pletora di condizioni patologiche che colpiscono il cervello. Usiamo queste tecniche per aiutarci a identificare bersagli trattabili da modulare in esperimenti futuri per stabilire relazioni meccanicistiche causali e, infine, con l'obiettivo di sviluppare nuove strategie terapeutiche per lesioni cerebrali traumatiche lievi.
