通过流细胞学测定，测量自然获得的噬菌体诱导恶性疟Plasmodium falciparum原虫抗体

该协议允许测量抗体对恶性疟原虫感染红细胞的吞咽和诱导细胞病的能力。可测试自然接触寄生虫感染的个体血清中的抗体，以及由寄生虫抗原免疫引起的抗体。与我一起演示这个程序的将是我实验室的技术人员迈肯·维斯蒂。

为了建立一个THP-1细胞培养物进行噬菌体测定，在实验前一天将细胞播种在25厘米方培养瓶中，浓度为2.5倍，10至5.5细胞，在THP一个细胞培养基中。在实验当天，在实验开始前至少一小时，每孔PBS中用150微升无菌2%FBS的圆底96孔板进行圆底。对于中晚期受三磷酸盐感染的红细胞的收获和纯化，在10毫升寄生虫培养基中准备约1.2毫升的包装P恶性疟原虫培养物，至少含有5%的寄生虫，并加入磁柱。

用50毫升的寄生虫培养培养培养剂清洗柱。要清除受感染的红细胞，请从磁铁上取下柱，用50毫升的寄生虫培养培养介质冲洗。然后，通过离心收集受感染的红细胞，将颗粒重新塞在一毫升新鲜寄生虫培养介质中进行计数。

将纯化受感染的红细胞悬浮液以含有溴化乙基的寄生虫培养基中每毫升第七细胞的3.3倍10调整为每毫升2.5微克的最终浓度。接下来，将板轻拂到废容器中，从一个 96 井板中去除阻塞溶液。然后去除纸巾上多余的，并添加30微升的溴化乙基标签感染红细胞悬浮液到所有，但一个井在板的上半部分。

在空井中加入30微升寄生虫培养培养剂，在室温下孵育板10分钟，防止光线。在孵育结束时，在每井中加入170微升寄生虫培养培养，通过离心沉淀被感染的红细胞。将上流水原轻拂到废物容器中，再清洗两次溴化乙基标记的受感染红细胞，每井有200微升的寄生虫培养培养基，刚才证明了这一点。

第二次洗涤后，使用多通道移液器小心地从每一个井中去除全量的上流液，而不会干扰颗粒。并在30微升抗体溶液中重新暂停溴化乙酰胺标记的感染红细胞，包括以前在寄生虫培养基中准备的适当对照和测试样品。然后，将板在37摄氏度下放置45分钟，防止光线。

当受感染的红细胞被解化时，通过离心收集THP-1细胞，并在12毫升新鲜、预热的THP-1细胞培养物中重新供应颗粒。第二次离心后，将颗粒重新在THP-1细胞培养的一毫升中重新加量进行计数，并在THP-1细胞培养中将细胞浓度调整为每毫升5倍至第5个细胞。从第二个96井板中去除阻解溶液，并将100微升的THP-1电池添加到每个井中。

然后，将板放在细胞培养箱中。在蛋白化孵化结束时，在蛋白化板的每个井中加入170微升的寄生虫培养培养，通过离心将受感染的红细胞沉淀到板块底部。每井用200微升的寄生虫培养剂两次清洗被感染的红细胞，使用多通道移液器在第二次洗涤后小心地去除上经剂。

在每井预加热的THP-1细胞培养物的100微升中重新悬浮受作用的受感染红细胞，并每井将50微升的受作用的受感染红细胞悬浮液转移到吞噬细胞细胞的对应井中。添加所有细胞后，将板放在细胞培养箱中不超过 40 分钟，防止光线。在孵育结束时，在摄氏四度时离心，停止吞噬。

去除上一甲酸，每井用150微升的室温氯化铵解溶液重新预支颗粒。整整三分钟后，在PBS中加入100微升的冰冷2%FBS，以阻止解变，通过离心沉淀完好的细胞。接下来，用200微升的新鲜冰冷2%FBS每井PBS洗三次，每次洗净。

最后洗涤后，将细胞颗粒重新在200微升新鲜冰冷2%FBS中重新暂停，每井PBS。对于流式细胞学采集和分析，立即将细胞加载到流式细胞仪上，并使用无感染红细胞的孔的线性前进和线性侧散射图来门控 THP-1 细胞。在此门中获取 10，000 个事件，并使用 THP-1 细胞与受感染的红细胞进行正对，以建立一个直方图，以测量溴化乙基荧光强度。

为了进行分析，打开没有感染红细胞的孔的线性前进和线性侧散射图，并打开 THP-1 细胞。然后，在 FL-3 直方图中设置一个正门，并复制这些门到所有其他样品井上，以确定溴化乙基阳性 THP-1 细胞的百分比。对于每个测试样本，吞噬症可以报告为绝对值，也可以报告为相对吞噬症，使用正对比作为最大值计算为百分比。

THP-1细胞应定期检查FC伽马受体表面表达通过流细胞仪。单元格对 CD16 应为负数，CD32 和 CD64 为正值。在这个结果化实验中，THP-1细胞首先根据其前向和侧散射特征进行门控，以便量化溴化乙基标记细胞的百分比，表明至少一个抗体蛋白分感染红细胞的细胞已经化为一个。

负对样本应在FL3通道中生成单个负峰，在溴化乙基标记中观察到的事件很少。因此，平均噬菌体值，无论是作为绝对乙基溴素阳性THP-1细胞，作为相对噬菌体百分比，应该非常低。相反，正对应产生两个峰值的痕迹，一个负峰和一个位于溴化乙基标记内的明显正峰和分离良好的峰。

阳性控制平均吞噬病值通常最高，其次是疟疾暴露的女性池和疟疾暴露妇女对照。尽管此方法生成一致的结果，但已观察到调整线的斜率系数的偏差。因此，建议使用相对值，尤其是在无法在单个实验中运行所有示例的情况下。

请务必提前仔细规划实验，同时准备THP-1细胞和寄生虫，仅使用纯度大于80%的营养细胞。此外，请务必始终包括适当的控制措施，以便评估实验质量，并方便数据分析。