이 프로토콜은 플라스모듐 falciparum 감염 한 적혈구의 phagocytosis를 opsonize 및 유도 하는 항체의 능력을 측정 할 수 있습니다. 기생충 감염에 자연적으로 노출된 개인의 혈청에 존재하는 항체뿐만 아니라 기생충 항원으로 예방 접종에 의해 유도된 항체는 시험될 수 있다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 마이켄 비스티, 내 실험실에서 기술자가 될 것입니다.
식세포 분석에 대한 THP-1 세포 배양을 설정하기 위해, 실험 전날 은 25센티미터 제곱 배양플라스크로 세포를 시드하고 THP 1 세포 배양 배지에서 밀리리터 당 5세포당 2.5배 10배의 농도를 시드한다. 실험 당일, 실험 블록 1시간 전부터 PBS에서 멸균 2%FBS 150마이크로리터를 갖춘 96웰 플레이트를 원형 바닥으로 차단한다. 중후반-투류좀에 감염된 적혈구 수확 및 정제를 위해, 기생충 배양 배지의 10밀리리터에서 포장된 P 팔시파룸 기생충 배양의 약 1.2 밀리리터를 준비하고, 적어도 5%의 기생충증을 가지고 자기 기둥에 추가한다.
기생충 배양 배지의 50 밀리리터로 컬럼을 세척하십시오. 감염된 적혈구를 털어내려면 자석에서 컬럼을 제거하고 기생충 배양 배지의 50 밀리리터로 세척합니다. 그런 다음, 원심분리에 의해 감염된 적혈구를 수집하고 계산을 위한 신선한 기생충 배양 배지의 1밀리리터에서 펠릿을 재중단한다.
정제된 에리스로세포 현탁액을 에티듐 브로마이드를 함유하는 기생충 배양 배지에서 밀리리터당 7번째 세포에 3.3배 10배, 밀리리터당 2.5 마이크로그램의 최종 농도로 조정한다. 다음으로 플레이트를 폐기물 용기에 밀어 넣음으로써 96웰 플레이트 1개에서 블로킹 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월위에 초과물을 제거하고 에티듐 브로마이드 라벨 감염 된 적혈구 현탁액의 30 마이크로 리터를 접시의 상부 절반에 있는 모든 우물을 제외한 모든 사람에게 추가하십시오.
빈 우물에 기생충 배양 매체 30 마이크로리터를 추가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 우물에 기생충 배양 배지의 170 마이크로리터를 추가하고 원심분리에 의해 플레이트의 바닥에 감염된 적혈구를 퇴적한다. 플레이트를 폐기물 용기에 밀어 넣는 것으로 상체를 제거하고, 에티듐 브로마이드 라벨에 감염된 적혈구를 두 번 더 세척하고, 200 마이크로리터의 기생충 배양 배지를 잘 세척하여 방금 입증하였다.
두 번째 세척 후, 여러 채널 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 각 우물에서 전체 체적을 조심스럽게 제거합니다. 그리고 이전에 기생충 배양 배지에서 제조된 적절한 제어 및 테스트 샘플을 포함하여 항체 용액의 30 마이크로리터에서 브로마이드 표지된 에티듐 브로마이드 표지된 에티듐을 재중단한다. 그런 다음, 빛으로부터 보호, 45 분 동안 섭씨 37도에 접시를 배치합니다.
감염된 적혈구가 전이되는 동안, 원심분리에 의해 THP-1 세포를 수집하고, 신선한, 미리 따뜻워진 THP-1 세포 배양 배지의 12 밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 두 번째 원심분리 후, THP-1 세포 배양 배지의 1밀리리터에서 펠릿을 재보중단하고, THP-1 세포 배양 배지에서 밀리리터당 5배 10까지 세포 농도를 조절한다. 두 번째 96웰 플레이트에서 차단 용액을 제거하고 각 웰에 100 마이크로리터의 THP-1 셀을 추가합니다.
그런 다음, 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓는다. 편손화 인큐베이션의 끝에서, 편화 플레이트의 각 웰에 기생충 배양 배지의 170 마이크로리터를 추가하고, 감염된 적혈구를 원심분리에 의해 플레이트 의 바닥에 침전물을 첨가한다. 2차 세척 후 상류제를 조심스럽게 제거하기 위해 다중 채널 파이펫을 사용하여 잘 당 200 마이크로리터의 기생충 배양 배지로 안진 감염된 적혈구를 두 번 세척합니다.
전동된 THP-1 세포 배양 배지의 100마이크로리터에서 opsonized 감염된 적혈구를 재중단하고, 각 opsonized 감염된 적혈구 현탁액의 50 마이크로리터를 phagocytosis 플레이트에 상응하는 우물로 이송한다. 모든 세포가 첨가되면, 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 40분 이상 배치하여 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션이 끝나면 섭씨 4도에서 원심분리로 식세포증을 중지하십시오.
상체를 제거하고 150 마이크로리터의 실온 염화 용액으로 펠릿을 잘 제거합니다. 정확히 3 분 후, 용액을 중지PBS에서 2 %FBS에서 얼음 차가운 100 마이크로 리터를 추가하고, 원심 분리에 의해 그대로 세포를 퇴적. 다음으로, 세척당 PBS에서 신선한 얼음 차가운 2%FBS 200 마이크로리터로 셀을 세 번 씻습니다.
마지막 세척 후, 잘 당 PBS에서 신선한 얼음 차가운 2 %의 마이크로 리터 200 마이크로 리터에 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 유동 세포측정습 및 분석을 위해, 즉시 세포를 유동 세포계에 적재하고, THP-1 세포를 게이트하기 위해 감염된 적혈구없이 우물에 대한 선형 전방 대 선형 측면 산란 플롯을 사용합니다. 이 게이트에서 10, 000개의 이벤트를 획득하고, 에디듐 브로마이드 형광 강도를 측정하기 위해 히스토그램 플롯을 설정하는 포지티드 컨트롤로 편손화된 감염된 적혈구를 가진 THP-1 세포를 사용한다.
분석을 위해, 감염된 적혈구없이 우물에 대한 선형 전방 및 선형 측 산란 플롯을 열고 THP-1 세포를 게이트한다. 그런 다음, FL-3 히스토그램에 양성 게이트를 설정하고 이 게이트를 다른 모든 샘플 우물에 복사하여 에티듐 브로마이드 양성 THP-1 세포의 백분율을 결정한다. 시험된 각 샘플에 대해, phagocytosis는 절대값으로 또는 양극을 최대로 사용하여 백분율로 계산된 상대식세포증으로 보고될 수 있다.
THP-1 세포는 혈류 세포측정에 의한 FC 감마 수용체 표면 발현을 주기적으로 검사해야 한다. 셀은 CD16에 대해 음수이어야 하며 CD32 및 CD64에 대해 양수여야 합니다. 이러한 편화 실험에서 THP-1 세포는 그들의 전방 및 측면 산란 프로파일에 따라 먼저 문이 되었고, 에티듐 브로마이드 표시 세포의 백분율의 정량화를 허용하고, 적어도 하나의 항체가 감염된 적혈구를 opsonized한 세포를 나타낸다.
음의 대조군 샘플은 모두 FL3 채널에서 단일 음수 피크를 생성해야 하며, 에티듐 브로마이드 마커에서 관찰되는 이벤트가 거의 없습니다. 따라서, 평균 식세포값은 절대에티듐 브로마이드 양성 THP-1 세포와 상대식세포 백분율로 매우 낮아야 한다. 대조적으로, 양수 제어는 두 개의 피크, 음수 피크 및 에티듐 브로마이드 마커 내에 있는 명확하고 양수적이고 잘 분리된 피크로 흔적을 생성해야 합니다.
평균 phagocytosis 값은 일반적으로 말라리아 노출된 여성 수영장 및 단 하나 말라리아 노출 여자 통제에 선행된 긍정적인 통제를 위해 일반적으로 최고입니다. 이 방법론은 일관된 결과를 생성하지만 조정된 선의 경사 계수의 편차가 관찰되었습니다. 따라서 상대값의 사용은 특히 단일 실험에서 모든 샘플을 실행할 수 없는 경우에 권장됩니다.
사전에 실험을 미리 계획하여 THP-1 세포와 기생충을 모두 준비하고, 80% 이상의 순도를 가진 트로포세포만을 사용하여, 실험의 품질을 평가하고 데이터 분석을 용이하게 하기 위해 항상 적절한 컨트롤을 포함해야 한다.
