このプロトコルは、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の貪食をオソナイズし、誘導する抗体の能力を測定することを可能にする。寄生虫感染に自然に曝露された個体の血清中に存在する抗体、ならびに寄生虫抗原による免疫によって誘導されるものは、試験することができる。私と一緒に手順を実証することは、私の研究室の技術者であるマイケン・ヴィスティです。
食細胞性アッセイ用のTHP-1細胞培養をセットアップするために、実験の前日に細胞を25センチメートルの二乗培養フラスコに播種し、THP1細胞培養培地で1ミリリットル当たり5番目の細胞に2.5倍の濃度を含む。実験の日には、実験ブロックの少なくとも1時間前に、PBSあたりPBSで150マイクロリットルの無菌2%FBSを持つラウンドボトム96ウェルプレートにブロックする。中期から後期に感染した熱帯赤血球の収穫および精製のために、少なくとも5%の寄生虫培養培地でパックされたP熱帯熱虫寄生虫培養の約1.2ミリリットルを調製し、少なくとも5%の寄生虫血症を有し、磁気カラムに加える。
50ミリリットルの寄生虫培養培地でカラムを洗います。赤血球を感染させた細胞を溶出させるために、磁石からカラムを取り出し、50ミリリットルの寄生虫培養培地で洗い流す。次いで、感染した赤血球を遠心分離によって収集し、カウント用の新鮮な寄生虫培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
精製された赤血球懸濁液を、臭化エチジウムを含む寄生虫培地中の1ミリリットル当たり7番目の細胞に10回3.3倍、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムの最終濃度に調整する。次に、プレートを廃棄物容器にフリックして、1つの96ウェルプレートからブロッキング溶液を取り除きます。その後、ペーパータオルの上に余分なものを取り除き、エチジウム臭化物ラベルの30マイクロリットルをプレートの上半分に1つの井戸を除くすべての赤血球懸濁液に加えます。
30マイクロリットルの寄生虫培養培地を空の井戸に加え、光から保護された室温で10分間プレートをインキュベートする。インキュベーションの終わりに、各ウェルに170マイクロリットルの寄生虫培養培地を加え、遠心分離によってプレートの底部にある感染した赤血球を沈下する。プレートを廃棄物容器にフリックして上澄み物を取り除き、エチジウム臭化物標識感染赤血球をさらに2回洗浄し、1井戸当たり200マイクロリットルの寄生虫培養培地を使用します。
2回目の洗浄後、マルチチャンネルピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく、各ウェルから上澄みのボリューム全体を慎重に除去します。そして、エチジウム臭化物標識された感染した赤血球を30マイクロリットルの抗体溶液中で再懸濁し、寄生虫培地で以前に調製した適切なコントロールおよび試験サンプルを含む。その後、光から保護された45分間、37°Cにプレートを置きます。
感染した赤血球がオソナイズされている間、遠心分離によってTHP-1細胞を採取し、新鮮で温め前のTHP-1細胞培養培地の12ミリリットルでペレットを再懸濁する。第2遠心分離後、カウント用THP-1細胞培養培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、THP-1細胞培養培地において1ミリリットル当たり5番目の細胞に5倍10倍に調整した。2番目の96ウェルプレートからブロッキング溶液を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルのTHP-1細胞を加えます。
次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。オプソナイゼーションインキュベーションの終わりに、オプソナイゼーションプレートの各ウェルに170マイクロリットルの寄生虫培養培地を加え、遠心分離によって感染した赤血球をプレートの底に沈下する。オプソナイズ化した感染した赤血球を1ウェルあたり200マイクロリットルの寄生虫培養培地で2回洗浄し、マルチチャネルピペットを使用して2回目の洗浄後に上清を慎重に除去する。
1ウェルあたり100マイクロリットルの前温めたTHP-1細胞培養培地中のオソニンした感染した赤血球を再懸濁し、各オプソン化された感染した赤血球懸濁液の50マイクロリットルを食細胞細胞プレートの対応するウェルに移す。すべての細胞を添加したら、プレートを細胞培養インキュベーターに40分以下で入れ、光から保護する。インキュベーションの終わりに、摂氏4度で遠心分離によって食細胞化を停止する。
上清を取り除き、ウェルあたり150マイクロリットルの室温塩化アンモニウム溶解溶液でペレットを再懸濁します。ちょうど3分後、PBSの2%FBSで100マイクロリットルの氷冷を加えて溶菌を止め、遠心分離によって無傷の細胞を沈下する。次に、200マイクロリットルの新鮮な氷冷2%FBSをPBSで200マイクロリットルで3回洗浄します。
最終洗浄後、新鮮な氷冷2%FBSをPBSで200マイクロリットルで細胞ペレットをPBSあたり再懸濁します。フローサイトメトリーの取得と分析のために、すぐにフローサイトメーターに細胞をロードし、THP-1細胞をゲートするために感染した赤血球なしでウェルの線形前方対線形側散布図を使用します。このゲートで10,000の事象を獲得し、感染した赤血球を陽性対照でオソナイズしたTHP-1細胞を使用して、エチジウム臭化物蛍光強度を測定するヒストグラムプロットを設定する。
分析のために、感染した赤血球を使わずにウェルの線形前方対線形側散布図を開き、THP-1細胞をゲートします。次に、FL-3ヒストグラムに正のゲートを設定し、これらのゲートを他のすべてのサンプルウェルにコピーして、臭化エチジウム陽性THP-1細胞の割合を決定します。試験した各サンプルについて、貪食は絶対値として、または陽性対照を最大として使用してパーセンテージとして計算された相対的な食細胞症として報告することができる。
THP-1細胞は、フローサイトメトリーによるFCガンマ受容体表面発現について定期的にチェックする必要があります。CD16 ではセルが負の値、CD32 および CD64 の場合は正の値にする必要があります。このオプソニン法実験では、THP-1細胞を前方および側面の散乱プロファイルに従って最初にゲート付けし、臭化エチジウム標識細胞の割合を定量化できるように、少なくとも1つの抗体を感染した赤血球に浸透させた細胞を示す。
陰性対照サンプルは、すべてFL3チャネルで単一の負のピークを生成する必要があり、エチジウム臭化マーカーで観察されるイベントはほとんどありません。したがって、平均食細胞化値は、絶対エチジウム臭化物陽性THP-1細胞として、および相対的な貪食率として、非常に低いはずです。対照的に、陽性対照は、2つのピーク、負のピークとエチジウム臭化マーカー内に位置する明らかに正でよく分離されたピークを持つトレースを生成する必要があります。
平均貪食症の値は、通常、陽性対照のために最も高く、次いでマラリアにさらされた女性プールと単一のマラリア暴露された女性コントロールが続く。この方法論は一貫した結果を生み出しますが、調整された線の傾き係数の偏差が観察されています。したがって、相対値を使用することをお勧めします、特に、すべてのサンプルを 1 回の実験で実行できない場合。
事前に実験を慎重に計画し、THP-1細胞と寄生虫の両方を適宜準備し、80%を超える純度を有するトロホシテのみを使用し、常に適切なコントロールを含め、実験の品質を評価し、データ分析を容易にするようにしてください。
