使用酶联免疫吸附测定法检测按蚊中的疟原虫孢子

ELISA技术对于检测蚊子载体中的疟疾寄生虫具有很高的灵敏度和特异性，并且能够同时处理大量样本。这种技术使研究人员能够保留蚊子样本，直到它们准备好进行样本处理，并且可以使用物种特异性单克隆抗体来区分疟原虫物种。通过将蚊子的头部和胸部与腹部分离来制备样品，并将它们放入预先标记的1.5毫升离心研磨管中。

向每个试管中加入 50 微升研磨缓冲液，并用研杵均质化样品。用 250 微升研磨缓冲液冲洗研杵，然后将溶液加入试管中，使最终体积达到 300 微升。准备环孢子蛋白的ELISA板，并填写子孢子体ELISA工作表。

在PBS中制备抗体溶液，每板加入5毫升溶液。将 50 微升抗体溶液移液到 ELISA 板的每个孔中。盖上盖子放在板上，在室温下孵育 30 分钟或过夜。

吸出孔中的溶液，然后用纸巾敲击板五次以除去液体。在孔板中加入 200 微升封闭缓冲液，并盖上盖子。在室温下孵育一小时，并吸出孔内容物。

再次用纸巾敲击板以去除液体。向 H 1 孔和 H 2 孔中加入 50 μL 阳性对照。然后向 C 行的第一列和第二列的孔中加入 50 微升封闭缓冲液至 G.将 50 微升阳性对照加入 G 一和 G 二孔中。

从G 1和G 2开始连续稀释阳性对照，然后是F 1和F 2，直到C 1和C 2。向孔 A 1、A 2、B 1 和 B 2 中加入 50 微升阴性对照。提取 50 微升匀浆溶液，并将其加入未知孔中。

盖上板，在室温下孵育两小时。通过将底物A和B以一比一的比例混合来制备底物溶液。通过向每个板中加入 5 毫升有效的偶联抗体溶液来确定所需的体积。

通过将 5 微升过氧化物酶标记的抗体溶液加入 1.5 毫升管中的 100 微升底物溶液中来评估过氧化物酶活性。吸出孔内容物，并将板倒置在纸巾上以除去液体。用 200 微升 PBS 吐温清洗孔两次。

吸出孔内容物，并敲击板五次。向每个孔中加入 50 微升过氧化物酶标记的抗体溶液。然后在室温下在黑暗中孵育一小时。

吸出孔内容物，然后用纸巾敲击板五次。用 200 微升 PBS 吐温清洗孔 3 次，吸出内容物，然后敲击板 5 次。向每个孔中加入 100 微升底物溶液。

盖上板，在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。孵育后，使用 ELISA 酶标仪读取 405 至 414 纳米处的吸光度。将吸光度值高于临界值的样品标记为阳性，并使用标准品确定样品中的CSP浓度。

绘制吸光度值与溶液浓度的关系图，以生成标准曲线。使用线性回归方法确定最佳拟合。求解阳性样品的每个吸光度值的方程，以确定CSP浓度。

使用 ABTS 进行 ELISA 30 分钟后，可以通过孔中出现微弱的绿色来检测孢子菌感染。阳性对照在孔中未显示任何颜色变化。测定了负孔和正孔的吸光度值。

阳性孔的吸光度值高于临界阈值，而阴性对照的吸光度值明显较低。此外，还获得了其他80个未知孔的吸光度值。实线表示阴性对照孔的平均吸光度，虚线表示阳性阈值。

使用标准曲线，确定A井7中的CSP浓度为0.35微克/微升 ELISA处理的这一步骤应迅速进行，以防止非特异性载体。此外，所有样品和溶液都应保存在冰箱中，以防止微生物生长。建议研究人员通过其他方法（如PCR）确认阳性检测结果。

这将显着提高置信度，尤其是当唯一的读数值高于阈值时。这种技术使研究人员能够对蚊子中可能的感染进行更大规模的调查，这对于确定主要传播媒介非常重要。