يسمح هذا البروتوكول بقياس قدرة الأجسام المضادة على الإرضاء والحث على بعتم البلازمات الفلاسية البلازميومية المصابة بالخيثارية. يمكن اختبار الأجسام المضادة الموجودة في مصل الأفراد المعرضين بشكل طبيعي لعدوى الطفيليات ، وكذلك تلك التي يتم تحريضها عن طريق التحصين بمستضدات الطفيليات. إثبات الإجراء معي سيكون مايكين فيستي، وهو فني من مختبري.
لإعداد ثقافة خلية THP-1 لمقايسة البلعوم، في اليوم السابق للتجربة بذور الخلايا في قارورة ثقافة مربعة 25 سنتيمترا وتركيز 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في THP خلية واحدة ثقافة المتوسطة. في يوم التجربة ، على الأقل ساعة واحدة قبل كتلة التجربة إلى 96-96- ألواح 96-جيدا الجولة مع microliters من العقيمة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في البئر. لحصاد وتنقية الخلايا الحمراء المصابة في منتصف إلى وقت متأخر من منتصف إلى مرحلة متأخرة ، قم بإعداد حوالي 1.2 ملليلتر من ثقافة طفيلي P الفاسيباروم المعبأة في 10 ملليلترات من متوسطة ثقافة الطفيليات ، مع ما لا يقل عن 5٪ من الطفيليات وإضافة إلى عمود مغناطيسي.
غسل العمود مع 50 ملليلتر من ثقافة الطفيلي المتوسطة. لerute المصابة الكريات الحمراء، وإزالة العمود من المغناطيس وتدفق عليه مع 50 ملليلتر من المتوسطة ثقافة الطفيليات. ثم، وجمع الكريات الحمراء المصابة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الطفيليات الطازجة ثقافة المتوسطة للعد.
ضبط تعليق كريات الدم الحمراء المصابة منقّحتها بمقدار 3.3 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر في وسط ثقافة الطفيليات التي تحتوي على بروميد الإثيديوم، إلى تركيز نهائي قدره 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك، قم بإزالة حل الحجب من لوحة 96-well واحدة عن طريق تمرير اللوحة إلى حاوية نفايات. ثم إزالة أي فائض على منشفة ورقية وإضافة 30 ميكرولترات من تسمية بروميد الإتيهيديوم المصابة تعليق كريات اللكرة الأحمر للجميع ولكن واحد جيدا في النصف العلوي من لوحة.
إضافة 30 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة إلى البئر الفارغة، واحتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة 170 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة لكل بئر والرواسب الكريات الحمراء المصابة في الجزء السفلي من لوحة عن طريق الطرد المركزي. إزالة supernatant عن طريق نفض الغبار لوحة في وعاء النفايات، وغسل الكريات الحمراء المسماة بروميد الإيثييوم المسمى المصابة مرتين أكثر، مع 200 ميكرولترات من ثقافة الطفيلي المتوسطة في جيدا، كما أظهرت للتو.
بعد الغسيل الثاني، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الحجم الكامل من المابس من كل بئر بعناية، دون إزعاج الكريات. وإعادة تعليق كريات الدم الحمراء المسماة ببروميد الإيثيديوم في 30 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة، بما في ذلك الضوابط المناسبة وعينات الاختبار التي تم إعدادها سابقًا في وسط ثقافة الطفيليات. ثم ضع اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ومحمية من الضوء.
في حين يتم opsonized الخلايا الحمراء المصابة ، وجمع الخلايا THP - 1 عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة بيليه في 12 ملليلتر من الطازجة ، قبل الدافئة THP - 1 خلية المتوسطة. بعد الطرد المركزي الثاني، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من THP-1 خلية ثقافة المتوسطة للعد، وضبط تركيز الخلية إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في خلية THP-1 المتوسطة. إزالة الحل حظر من لوحة 96-جيدا الثانية وإضافة 100 ميكرولترات من الخلايا THP-1 إلى كل بئر.
ثم، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة opsonization، إضافة 170 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة إلى كل بئر من لوحة opsonization، ورواسب الكريات الحمراء المصابة إلى الجزء السفلي من لوحة عن طريق الطرد المركزي. غسل الكريات الحمراء المصابة opsonized مرتين مع 200 ميكرولترات من ثقافة الطفيلي المتوسطة في البئر ، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة بعناية supernatant بعد الغسيل الثاني.
Resuspend الخلايا الكريات الحمراء المصابة opsonized في 100 microliters من قبل الدافئ THP-1 خلية ثقافة المتوسطة في البئر ، ونقل 50 ميكرولترات من كل تعليق الكريات الحمراء المصابة opsonized إلى بئر المقابلة في لوحة البلعمية. عندما يتم إضافة جميع الخلايا، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة لا تزيد عن 40 دقيقة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، أوقف البلعوم عن طريق الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية.
إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات مع 150 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة الأمونيوم كلوريد محلول في بئر. بعد ثلاث دقائق بالضبط ، إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد في 2 ٪ FBS في برنامج تلفزيوني لوقف التحلل ، ورواسب الخلايا السليمة عن طريق الطرد المركزي. المقبل، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من الجليد الطازج الباردة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في بئر، في غسل.
بعد الغسيل النهائي، resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولترات من الجليد الطازج الباردة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في البئر. للحصول على تحليل وتحليل قياس الخلايا التدفقي، قم على الفور بتحميل الخلايا على مقياس تدفق الخلايا واستخدم مؤامرة التشتت الجانبي الخطي مقابل الخطية للآبار بدون كريات الدم الحمراء المصابة إلى بوابة خلايا THP-1. الحصول على 10،000 الأحداث في هذه البوابة، واستخدام الخلايا THP-1 مع الكريات الحمراء المصابة opsontes مع سيطرة إيجابية لإعداد مؤامرة الرسم البياني لقياس كثافة الفلورية بروميد الإيثيديوم.
للتحليل، افتح مؤامرة التشتت الجانبي الخطي مقابل الخطية للآبار بدون كريات الدم الحمراء المصابة، وابابة خلايا THP-1. ثم قم بإعداد بوابة إيجابية في رسم بياني من نوع FL-3 ونسخ هذه البوابات على جميع آبار العينة الأخرى لتحديد النسبة المئوية للخلايا THP-1 الإيجابية لبروميديوم. لكل عينة تم اختبارها ، يمكن الإبلاغ عن البلعمية على أنها القيمة المطلقة أو باعتبارها البلعمة النسبية المحسوبة كنسبة مئوية باستخدام التحكم الإيجابي كحد أقصى.
يجب فحص خلايا THP-1 بشكل دوري للتعبير السطحي لمستقبلات FC غاما عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة. يجب أن تكون الخلايا سالبة لـ CD16، وإيجابية لـ CD32 و CD64. في تجربة opsonization هذه، تم بوابات الخلايا THP-1 أولاً وفقاً لمحاتها الأمامية والجانبية مبعثر، للسماح quantization النسبة المئوية للخلايا المسماة بروميد الإتيهيديوم، مؤشراً للخلايا التي بعتها الأجسام المضادة واحد على الأقل opsonized الكريات الحمراء المصابة.
وينبغي أن تولد عينات التحكم السلبية جميعها ذروة سلبية واحدة في قناة FL3، مع وجود عدد قليل من الأحداث التي لوحظت في علامة بروميد الإتيهيدوم. وبناء على ذلك، ينبغي أن تكون قيم البلعيات المتوسطة، سواء كخلايا THP-1 الإيجابية المطلقة من بروميد الإتربي أو كنسب مئوية نسبية للداءات البلعمية، منخفضة جداً. وعلى النقيض من ذلك، ينبغي أن تولد الرقابة الإيجابية آثاراً ذات ذرتين، وذرية سالبة، وذرية موجبة ومفصلة بشكل جيد تقع ضمن علامة بروميد الإثيديوم.
وعادة ما تكون قيم البلعوم المتوسط هي الأعلى بالنسبة للسيطرة الإيجابية، تليها مجموعة الإناث المعرضة للملاريا وضوابط المرأة الوحيدة المعرضة للملاريا. وعلى الرغم من أن هذه المنهجية تولد نتائج متسقة، فقد لوحظت انحرافات في معامل الميل للخطوط المعدلة. لذلك، يوصى باستخدام القيم النسبية، خاصةً إذا لم يكن من الممكن تشغيل كافة العينات في تجربة واحدة.
تأكد من التخطيط بعناية للتجربة مسبقًا ، وإعداد كل من خلايا THP-1 والطفيليات وفقًا لذلك ، باستخدام ال trophocytes فقط مع نقاء أكبر من 80٪ بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تضمين دائمًا الضوابط المناسبة ، للسماح بتقييم جودة التجربة وتسهيل تحليل البيانات.
