单细胞级别研究形状依赖性转录组学的方法

我们提出了一个新的平台，用于研究细胞形状对基因表达的影响，使用方法在单个细胞水平上生长和排序不同形态的依从性。该技术的主要优点是，它有利于在体外对细胞形状的高通量研究，因为比较体内不同形状的细胞在技术上要求很高。要建立有图案的心肌细胞培养，将息高比下的心向位的心向位肌细胞悬浮液转移到15毫升管中，以计数，将细胞稀释至适当电镀介质浓度的每毫升10至5个细胞的1倍至5个细胞。

将两毫升细胞加入纤维素涂层微层芯片，浸入两毫升热电镀介质中，在35毫升的Grenier Petri盘中，将该培养皿放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中18小时。第二天，通过光显微镜检查芯片，确认大部分细胞已经连接。从培养皿中去除培养皿中的介质以清除任何碎屑和或死细胞，然后从中心开始，以滴滴的方式向两侧移动，轻轻地向细胞中添加 PBS。

第三次洗涤后，用四毫升维持介质更换PBS，将细胞返回细胞培养箱。72 小时后，使用两毫升加热 Dulbecco 的 PBS 轻轻冲洗芯片表面，如演示，并使用钳子立即将洗涤的碎屑转移到新的无菌 35 毫升 Grenier Petri 盘中。快速添加 1.5 微升的充满活力的二环绿色稀释 1000 折的 DPBS 芯片。

在芯片上固定一个室，将盘子放在细胞拾取器阶段的菜架上。插入磁帽，并在实时视图窗口中定位十字线。聚焦十字线，在扫描和分拣窗口中，选择自动喷射和校准的校准。

在 DPBS 溶液中，用 1.5 毫升的一对一三 E 将盘子上足液更换，以松开纤维素中的细胞并打开扫描卡舌。要扫描整个芯片，请聚焦视野中芯片左上角，然后单击获取当前显微镜位置。接下来，聚焦芯片右下角，然后单击获取当前显微镜位置。

在弹出窗口中，单击"设置最锐利的平面"，然后单击"转到右上角"，然后转到左下角按钮。然后，单击"完成"开始扫描。扫描完成后，打开分析选项卡并单击"显示映射"以选择通过研究标准的单个单元格。

将玻璃微胶囊放在显微镜中间的实时视图中，然后打开泵卡舌。要产生真空，请从 50 毫升 1 号注射器中收回柱塞，然后打开分拣卡舌。为了允许拾取单个单元，请将阀 2 设置为打开 120 毫秒，在 200 毫秒的延时后将阀 1 打开 20 毫秒。

为使拾取的电池成功送至包含开液缓冲液的PCR管，请将阀一打开20毫秒，将阀门二在10毫秒的延时后打开10毫秒。调整阀门设置后，单击计算路径。该软件将计算从细胞到细胞的最快路径，以在整个芯片中拾取和注射选定的细胞。

然后，将显微镜聚焦在芯片表面的图案上。使用操纵手柄小心地向下移动微盖拉，以便无需接触芯片表面并单击设置即可获得微盖拉片尖端最清晰的图像。将打开一个新窗口，显示微胶囊横截面。

要让软件在 X、Y 和 Z 坐标中记录毛细管的尖端偏移，请单击毛细管的确切中心。然后，单击"开始排序"以启动排序。在从采摘的单细胞对预扩增cDNA进行这种代表性分析中，观察到凝胶中的一个透明带，如密度测定图，与电图中1，852个碱基对的峰值相对应。

片段的平均大小为 1，588 个基对，其碎片数量很少，短于 300 个基对，表示生成了良好的 cDNA 库。免疫荧光染色和分析也可以进行评估模式性心肌细胞内的沙康体结构。该平台为高通量研究和对不同类型的心力衰竭进行药物筛查铺平了道路。