自由行为 秀丽隐杆线虫 的钙成像，具有良好控制，非局部化振动

我们的系统允许研究人员在非缩放位移下引起具有良好控制特性的非局部振动，并在刺激物对振动的反应期间量化钙电流。作为该技术的主要优点，我们可以无创地研究神经机制，即行为的潜在机制。准备一种新的线虫生长培养基或NGM板，其上使用细胞传播器将大肠杆菌OP50以方形图案条纹，以便蠕虫在钙成像期间将大部分时间花在细菌中。

在钙成像实验前四天，将两个成年ST12蠕虫转移到平板上，并将板置于20摄氏度的培养箱中四天。使用配备用于刺激的声学换能器装置，2倍物镜，高速CMOS相机，图像分裂光学元件的显微镜进行钙成像。打开 X Y 电动载物台控制器中的精密计算机。

然后打开放大器，将低音扬声器中的音量调节器设置为10，将高音调节器设置为8。要激发 GCaMP 并标记 RFP，请打开 LED 光源的 488 和 560 纳米灯。将光源中控制舱的470和550纳米规格设置为5%，以便LED光的强度适合成像。

下载并安装以下软件包和窗口。鼠标宏软件、振动控制软件、运行跟踪软件和数据分析软件。双击跟踪软件文件，然后将曝光时间设置为0.033秒，并分档到二乘二，以确保图像采集流畅。

单击运行按钮并等待五分钟以稳定软件。输入用于图像采集的信息。例如，若要记录 500 张没有间隔的图像，请在"图像总数"框中输入 500，在"图像"框中输入 500，在"间隔"框中输入零。

打开采集按钮后，使用图像分割光学元件分割荧光图像，将GCaMP通道和标签RFP通道投影到CMOS相机的两半上。校准 GCaMP 的坐标并标记 RFP 通道并保存设置。然后设置目录以输出数据文件并关闭采集。

阅读测定。文本文件与鼠标宏系统，以便根据该文件中的坐标和时间表控制鼠标光标，并双击软件文件进行振动控制。在开始记录后，在等待刺激之前设置鼠标光标的坐标，然后在软件中设置频率和振幅值以进行振动控制。

将表达 GCaMP 和标签 RFP 的单个蠕虫从孵育板转移到新的 NGM 板中，其中大肠杆菌 OP50 已划线。使用透明胶带将NGM板连接到声学传感器上。对于钙成像，请打开采集按钮，以 2.5 倍放大倍率找到蠕虫。

将视场设置为 1.1 x 1.1 毫米，分辨率为每像素 2.6 微米。关闭强光并单击归位按钮以跟踪蠕虫的荧光点，从而启动X Y载物台的运动，以在标签RFP图像中将蠕虫的最大强度区域保持在视野中间。确保强度值约为 1000。

如果没有，请微调光源中控制舱的470和550纳米规格。按鼠标宏系统中的运行按钮以允许鼠标光标控制，并验证是否正确创建了输出 BMP 文件。对于数据分析，请在桌面上创建一个文件夹并将其命名为"钙成像"，然后在钙成像文件夹中创建一个文件夹，并将其命名为输出结果文件的CI结果。

双击双视图成像。MB文件写入数据分析软件，并将文件路径插入到CI结果文件夹中的BMP文件中。同时按下移位键和返回键以开始自动分析，该分析使用标签RFP图像中最大强度区域的值。

最后，检查是否在 CI 结果文件夹中正确创建了输出文件。在代表性分析中，GCaMP和标签RFP信道数据作为一系列图像获得。还量化了由非局部振动系统引起的培养皿的位移。

位移可以通过在振动控制软件，音量调节器和放大器中设置幅度值来控制。而频率可以通过在软件中设置频率值来调节。在振动频率为630赫兹，位移约为每秒4.5微米的振动刺激下，观察到AVA神经元的瞬时钙反应，这表明Ava神经元在蠕虫对非局部刺激的向后反应期间被激活。

在我们的程序中，我们只能量化单个神经元。然而，该系统也可以与生物识别成像方法相结合，以无创地量化多个神经元甚至整个大脑。