우리의 시스템은 연구원들이 비스케일 변위에서 잘 제어되는 특성을 가진 비국부적 진동을 불러일으키고 진동에 대한 자극제의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 기술의 주요 장점으로, 우리는 비침습적으로 행동의 기본 메커니즘 인 신경 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. Escherichia coli OP50이 칼슘 이미징 중에 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 세포 스프레더를 사용하여 사각형 패턴으로 줄무늬가있는 새로운 선충류 성장 배지 또는 NGM 플레이트를 준비하십시오.
칼슘 이미징 실험 나흘 전에 성인 ST12 웜 두 개를 플레이트에 옮기고 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터에 나흘 동안 놓습니다. 자극을 위한 음향 트랜스듀서 장치, 2x 대물 렌즈, 고속 CMOS 카메라, 이미지 분할 광학이 장착된 현미경을 사용하여 칼슘 이미징을 수행합니다. X Y 전동 스테이지 컨트롤러에서 정밀 컴퓨터를 켭니다.
그런 다음 앰프를 켜고 볼륨 조절기를 베이스에서 10으로 설정하고 고음 조절기를 여덟 개로 설정합니다. GCaMP를 자극하고 RFP에 태그를 지정하려면 LED 광원의 488 및 560 나노 미터 조명을 켭니다. 광원에 있는 제어 포드의 470 및 550 나노미터 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다.
다음 소프트웨어 패키지 및 창을 다운로드하여 설치합니다. 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 제어 소프트웨어, 추적 실행 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어. 추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭 한 다음 노출 시간을 0.033 초로 설정하고 두 개씩 비닝하여 원활한 이미지 수집을 보장합니다.
실행 버튼을 클릭하고 소프트웨어를 안정화하기 위해 다섯 분 동안 기다립니다. 이미지 수집을 위한 정보를 입력합니다. 예를 들어 간격 없이 500개의 이미지를 기록하려면 이미지 합계 상자에 500을, 이미지 상자에 500을, 간격 상자에 0을 입력합니다.
획득 버튼을 켠 후 이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고 GCaMP 채널을 투사하고 RFP 채널을 CMOS 카메라의 두 반쪽에 태그합니다. GCaMP의 좌표를 보정하고 RFP 채널에 태그를 지정하고 설정을 저장합니다. 그런 다음 데이터 파일을 출력하고 수집을 끄도록 디렉토리를 설정하십시오.
분석을 읽으십시오. 마우스 매크로 시스템이있는 텍스트 파일을 사용하여 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되고 진동 제어를 위해 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오. 기록을 시작한 후 자극까지 대기 시간에 마우스 커서의 좌표를 설정 한 다음 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정하십시오.
GCaMP 및 태그 RFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 E coli OP50이 줄무늬가 있는 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 음향 트랜스듀서에 부착합니다. 칼슘 이미징의 경우 수집 버튼을 켜고 2.5x 배율로 웜을 찾으십시오.
시야각을 픽셀당 2.6미크론의 해상도로 1.1 x 1.1밀리미터로 설정합니다. 밝은 빛을 끄고 호밍 버튼을 클릭하여 웜의 형광 스폿을 추적하면 X Y 단계의 이동이 시작되어 태그 RFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다. 강도 값이 약 1000인지 확인하십시오.
그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470 및 550 나노 미터 게이지를 미세 조정하십시오. 마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 마우스 커서 제어를 허용하고 출력 BMP 파일이 적절하게 생성되었는지 확인합니다. 데이터 분석을 위해 바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 Calcium Imaging"으로 지정한 다음 Calcium Imaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일의 이름을 CI result로 지정합니다.
듀얼 뷰 이미징을 두 번 클릭합니다. MB 파일은 데이터 분석 소프트웨어에 기록되고, BMP 파일이 있는 폴더에 CI 결과 폴더에 파일 경로를 삽입한다. 시프트와 리턴 키를 동시에 눌러 태그 RFP 이미지에서 최대 강도 영역의 값을 사용하는 자동 분석을 시작합니다.
마지막으로 출력 파일이 CI 결과 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오. 대표적인 분석에서, GCaMP 및 태그 RFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 얻어졌다. 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 접시의 변위도 또한 정량화되었다.
변위는 진동 제어를위한 소프트웨어에서 진폭 값을 설정하고 볼륨 조절기 및 증폭기를 설정하여 제어 할 수 있습니다. 반면 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조정할 수 있습니다. AVA 뉴런의 일시적인 칼슘 반응은 630 헤르츠의 주파수와 초당 약 4.5 마이크로미터의 변위를 갖는 진동으로 자극시 관찰되었으며, 이는 아바 뉴런이 비국소 자극에 대한 웜의 후진 반응 중에 활성화되었음을 나타낸다.
우리의 절차에서, 우리는 단지 하나의 뉴런을 정량화 할 수 있습니다. 그러나이 시스템은 생체 인식 이미징 방법과 결합하여 비침습적으로 여러 뉴런 또는 심지어 전체 뇌를 정량화 할 수도 있습니다.
