Il nostro sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento non scalato e di quantificare la corrente di calcio durante le risposte delle sostanze irritanti alle vibrazioni. Come principale vantaggio di questa tecnica, possiamo indagare in modo non invasivo i meccanismi neurali, i meccanismi alla base del comportamento. Preparare un nuovo mezzo di crescita del nematode o una piastra NGM su cui Escherichia coli OP50 è striato in uno schema quadrato utilizzando uno spandicellulare in modo che il verme trascorra la maggior parte del tempo nei batteri durante l'imaging del calcio.
Quattro giorni prima di un esperimento di imaging del calcio, trasferire due vermi ST12 adulti sulla piastra e posizionare la piastra in un'incubatrice a 20 gradi Celsius per quattro giorni. Esegui l'imaging del calcio utilizzando un microscopio dotato di un dispositivo trasduttore acustico per la stimolazione, una lente obiettivo 2x, una fotocamera CMOS ad alta velocità, ottica di divisione delle immagini. Accendere il computer di precisione nel controller dello stage motorizzato X Y.
Quindi accendere l'amplificatore e impostare il regolatore del volume su 10 nella base e i regolatori degli alti su otto. Per eccitare GCaMP e taggare RFP, accendi le luci a 488 e 560 nanometri della sorgente luminosa a LED. Impostare i calibri da 470 e 550 nanometri del pod di controllo nella sorgente luminosa al 5% in modo che l'intensità della luce LED sia adatta per l'imaging.
Scaricare e installare i seguenti pacchetti software e windows. Software macro del mouse, software per il controllo delle vibrazioni, software per il monitoraggio dell'esecuzione e software per l'analisi dei dati. Fare doppio clic sul file del software di tracciamento, quindi impostare il tempo di esposizione su 0,033 secondi e associare a due a due per garantire un'acquisizione fluida delle immagini.
Fare clic sul pulsante Esegui e attendere cinque minuti per stabilizzare il software. Immettere le informazioni per l'acquisizione delle immagini. Ad esempio, per registrare 500 immagini senza intervallo, immetterne 500 nella casella totale immagini, 500 nella casella immagini e zero nella casella intervalli.
Dopo aver attivato il pulsante di acquisizione, dividere l'immagine a fluorescenza utilizzando l'ottica di divisione dell'immagine, proiettando il canale GCaMP e il canale RFP del tag su due metà della fotocamera CMOS. Calibrare le coordinate del GCaMP e taggare i canali RFP e salvare le impostazioni. Quindi impostare la directory per l'output del file di dati e disattivare l'acquisizione.
Leggi il test. file di testo con il sistema macro del mouse in modo che il cursore del mouse sia controllato in base alle coordinate e alla pianificazione in quel file e fare doppio clic sul file software per il controllo delle vibrazioni. Impostare le coordinate del cursore del mouse in tempo di attesa fino alla stimolazione dopo l'avvio della registrazione, quindi impostare i valori di frequenza e ampiezza nel software per il controllo delle vibrazioni.
Trasferire un singolo worm che esprima sia GCaMP che tag RFP dalla piastra incubata a una piastra NGM fresca in cui E coli OP50 è stato striato. Fissare la piastra NGM al trasduttore acustico utilizzando nastro adesivo trasparente. Per l'imaging del calcio, attivare il pulsante di acquisizione e trovare il worm con ingrandimento di 2,5x.
Impostare il campo visivo su 1,1 per 1,1 millimetri con una risoluzione di 2,6 micron per pixel. Spegni la luce intensa e fai clic sul pulsante di homing per tracciare il punto fluorescente di un worm, che avvia il movimento dello stadio X Y per mantenere la regione di massima intensità del worm al centro del campo visivo nell'immagine RFP del tag. Assicurarsi che i valori di intensità siano circa 1000.
In caso contrario, mettere a punto i calibri da 470 e 550 nanometri del pod di controllo nella sorgente luminosa. Premere il pulsante Esegui nel sistema macro del mouse per consentire il controllo del cursore del mouse e verificare che il file BMP di output sia stato creato in modo appropriato. Per l'analisi dei dati, creare una cartella sul desktop e denominarla Calcium Imaging", quindi creare una cartella all'interno della cartella Calcium Imaging e denominarla risultato CI per i file dei risultati di output.
Fare doppio clic sull'imaging a doppia vista. MB scritto nel software di analisi dei dati e inserire i percorsi dei file nella cartella dei risultati CI nella cartella con il file BMP. Premere contemporaneamente i tasti Shift e Return per avviare un'analisi automatica, che utilizza il valore di una regione di intensità massima nell'immagine RFP del tag.
Infine, controlla se i file di output sono creati in modo appropriato nella cartella dei risultati CI. Nell'analisi rappresentativa, i dati del canale GCaMP e tag RFP sono stati ottenuti come una serie di immagini. È stato inoltre quantificato lo spostamento della capsula di Petri indotto da un sistema di vibrazione non localizzato.
Lo spostamento può essere controllato impostando il valore di ampiezza nel software per il controllo delle vibrazioni, il regolatore di volume e l'amplificatore. Mentre la frequenza può essere regolata impostando il valore di frequenza nel software. Una risposta transitoria al calcio dei neuroni AVA è stata osservata dopo stimolazione con vibrazioni con una frequenza di 630 Hertz e uno spostamento di circa 4,5 micrometri al secondo, indicando che il neurone Ava è stato attivato durante la risposta all'indietro di un verme alla stimolazione non localizzata.
Nella nostra procedura, possiamo quantificare solo un singolo neurone. Tuttavia, questo sistema può anche essere combinato con un metodo di imaging biometrico per quantificare in modo non invasivo più neuroni o persino l'intero cervello.
