Notre système permet aux chercheurs d’évoquer des vibrations non localisées avec des propriétés bien contrôlées à déplacement non dimensionné et de quantifier le courant calcique lors des réponses des irritants aux vibrations. Comme principal avantage de cette technique, nous pouvons étudier de manière non invasive les mécanismes neuronaux, mécanismes sous-jacents du comportement. Préparez un nouveau milieu de croissance de nématode ou une plaque NGM sur laquelle Escherichia coli OP50 est strié dans un motif carré à l’aide d’un épandeur de cellules afin que le ver passe la plupart du temps dans les bactéries pendant l’imagerie calcique.
Quatre jours avant une expérience d’imagerie calcique, transférez deux vers ST12 adultes sur la plaque et placez la plaque dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant quatre jours. Effectuer une imagerie calcique à l’aide d’un microscope équipé d’un transducteur acoustique pour la stimulation, d’un objectif 2x, d’une caméra CMOS haute vitesse, d’une optique de fractionnement d’image. Allumez l’ordinateur de précision dans le contrôleur de scène motorisé X Y.
Allumez ensuite l’amplificateur et réglez le réglage du volume sur 10 dans la base et les régulateurs d’aigus sur huit. Pour exciter GCaMP et étiqueter RFP, allumez les lumières de 488 et 560 nanomètres de la source lumineuse LED. Réglez les jauges de 470 et 550 nanomètres du module de commande dans la source lumineuse à 5% afin que l’intensité de la lumière LED soit adaptée à l’imagerie.
Téléchargez et installez les progiciels et Windows suivants. Logiciel de macro de souris, logiciel de contrôle des vibrations, logiciel de suivi de l’exécution et logiciel d’analyse des données. Double-cliquez sur le fichier du logiciel de suivi, puis réglez le temps d’exposition à 0,033 seconde et binning à deux par deux pour assurer une acquisition d’image fluide.
Cliquez sur le bouton Exécuter et attendez cinq minutes pour stabiliser le logiciel. Entrez les informations pour l’acquisition d’images. Par exemple, pour enregistrer 500 images sans intervalle, entrez 500 dans la zone Total des images, 500 dans la zone Images et zéro dans la zone Intervalles.
Après avoir activé le bouton d’acquisition, divisez l’image de fluorescence à l’aide d’une optique de fractionnement d’image, en projetant le canal GCaMP et le canal RFP sur deux moitiés de la caméra CMOS. Calibrez les coordonnées du GCaMP et étiquetez les canaux RFP et enregistrez les paramètres. Ensuite, définissez le répertoire pour sortir le fichier de données et désactivez l’acquisition.
Lisez le test. fichier texte avec le système de macro de la souris afin que le curseur de la souris soit contrôlé en fonction des coordonnées et de la planification dans ce fichier et double-cliquez sur le fichier logiciel pour le contrôle des vibrations. Réglez les coordonnées du curseur de la souris en temps d’attente jusqu’à la stimulation après le démarrage de l’enregistrement, puis réglez les valeurs de fréquence et d’amplitude dans le logiciel pour le contrôle des vibrations.
Transférez un seul ver exprimant à la fois GCaMP et tag RFP de la plaque incubée vers une plaque NGM fraîche où E coli OP50 a été strié. Fixez la plaque NGM au transducteur acoustique à l’aide d’un ruban adhésif transparent. Pour l’imagerie calcique, allumez le bouton d’acquisition et recherchez le ver à un grossissement de 2,5x.
Définissez le champ de vision sur 1,1 par 1,1 millimètre avec une résolution de 2,6 microns par pixel. Éteignez la lumière vive et cliquez sur le bouton de repérage pour suivre la tache fluorescente d’un ver, ce qui déclenche le mouvement de l’étage X Y pour maintenir la région d’intensité maximale du ver au milieu du champ de vision dans l’image d’appel d’offres de l’étiquette. Assurez-vous que les valeurs d’intensité sont d’environ 1000.
Sinon, ajustez finement les jauges de 470 et 550 nanomètres du module de commande dans la source lumineuse. Appuyez sur le bouton Exécuter dans le système de macros de la souris pour permettre le contrôle du curseur de la souris et vérifiez que le fichier BMP de sortie est correctement créé. Pour l’analyse des données, créez un dossier sur le bureau et nommez-le Calcium Imaging » puis créez un dossier à l’intérieur du dossier Calcium Imaging et nommez-le résultat CI pour les fichiers de résultats de sortie.
Double-cliquez sur l’imagerie double vue. MB écrit dans le logiciel d’analyse de données et insérez les chemins d’accès au dossier de résultats CI dans le dossier avec le fichier BMP. Appuyez simultanément sur les touches Maj et Retour pour lancer une analyse automatique, qui utilise la valeur d’une région d’intensité maximale dans l’image RFP de la balise.
Enfin, vérifiez si les fichiers de sortie sont correctement créés dans le dossier de résultats CI. Dans l’analyse représentative, les données sur les BPF et les canaux d’appel d’offres ont été obtenues sous la forme d’une série d’images. Le déplacement de la boîte de Petri induit par un système vibratoire non localisé a également été quantifié.
Le déplacement peut être contrôlé en réglant la valeur d’amplitude dans le logiciel de contrôle des vibrations, ainsi que dans le régulateur de volume et l’amplificateur. Alors que la fréquence peut être réglée en réglant la valeur de fréquence dans le logiciel. Une réponse calcique transitoire des neurones AVA a été observée lors de la stimulation avec des vibrations ayant une fréquence de 630 Hertz et un déplacement d’environ 4,5 micromètres par seconde, indiquant que le neurone Ava a été activé lors de la réponse inverse d’un ver à la stimulation non localisée.
Dans notre procédure, nous ne pouvons quantifier qu’un seul neurone. Cependant, ce système peut également être combiné avec une méthode d’imagerie biométrique pour quantifier de manière non invasive plusieurs neurones ou même l’ensemble du cerveau.
