Nosso sistema permite que os pesquisadores evoquem vibrações não localizadas com propriedades bem controladas em deslocamento não dimensionado e quantifiquem a corrente de cálcio durante as respostas dos irritantes às vibrações. Como principal vantagem dessa técnica, não podemos investigar invasivamente os mecanismos neurais, mecanismos subjacentes ao comportamento. Prepare um novo meio de crescimento de nematoide ou placa de NGM na qual Escherichia coli OP50 é listrado em um padrão quadrado usando um espalhador de células para que o verme passe a maior parte do tempo na bactéria durante a imagem de cálcio.
Quatro dias antes de um experimento de imagem de cálcio, transfira dois vermes ST12 adultos para a placa, e coloque a placa em uma incubadora de 20 graus Celsius por quatro dias. Realize imagens de cálcio usando um microscópio equipado com um dispositivo transdutor acústico para estimulação, uma lente objetiva 2x, uma câmera CMOS de alta velocidade, óptica de divisão de imagens. Ligue o computador de precisão no controlador de estágio motorizado X Y.
Em seguida, ligue o amplificador e ajuste o ajustador de volume para 10 na base e os ajustadores de agudos para oito. Para excitar gcamp e tag RFP, ligue as luzes de 488 e 560 nanômetros da fonte de luz LED. Coloque os medidores de 470 e 550 nanômetros da cápsula de controle na fonte de luz até 5%, de modo que a intensidade da luz LED seja adequada para a imagem.
Baixe e instale os seguintes pacotes de software e janelas. Software de macro do mouse, software para controle de vibração, software para rastreamento de execução e software para análise de dados. Clique duas vezes no arquivo do software de rastreamento e, em seguida, defina o tempo de exposição para 0,033 segundos e binning para dois a dois para garantir a aquisição de imagem suave.
Clique no botão executar e aguarde por cinco minutos para estabilizar o software. Insira as informações para aquisição de imagens. Por exemplo, para gravar 500 imagens sem intervalo, digite 500 na caixa total de imagens, 500 na caixa de imagens e zero na caixa de intervalos.
Depois de ligar o botão de aquisição, divida a imagem de fluorescência usando óptica de divisão de imagem, projetando o canal GCaMP e marque o canal RFP em duas metades da câmera CMOS. Calibrar as coordenadas dos canais GCaMP e marcar RFP e salvar as configurações. Em seguida, defina o diretório para a saída do arquivo de dados e desligue a aquisição.
Leia o ensaio. arquivo de texto com o sistema de macro do mouse para que o cursor do mouse seja controlado com base nas coordenadas e no cronograma desse arquivo e clique duas vezes no arquivo de software para controle de vibração. Defina as coordenadas do cursor do mouse em tempo de espera até a estimulação após o início da gravação, em seguida, defina a frequência e os valores de amplitude no software para controle de vibração.
Transfira um único worm expressando gcamp e tag RFP da placa incubada para uma placa NGM fresca onde E coli OP50 foi listrado. Conecte a placa NGM ao transdutor acústico usando fita adesiva transparente. Para imagens de cálcio, ligue o botão de aquisição e encontre o verme em 2,5x de ampliação.
Defina o campo de visão como 1,1 por 1,1 milímetro com uma resolução de 2,6 mícrons por pixel. Desligue a luz brilhante e clique no botão de ving para rastrear o ponto fluorescente de um worm, que inicia o movimento do estágio X Y para manter a região de intensidade máxima do worm no meio do campo de visão na imagem da tag RFP. Certifique-se de que os valores de intensidade são aproximadamente 1000.
Se não, ajuste bem os medidores de 470 e 550 nanômetros da cápsula de controle na fonte de luz. Pressione o botão de execução no sistema de macro do mouse para permitir o controle do cursor do mouse e verifique se o arquivo BMP de saída foi criado adequadamente. Para análise de dados, crie uma pasta na área de trabalho e nomeie-a de Imagem de Cálcio" em seguida, crie uma pasta dentro da pasta Imagem de Cálcio e nomeie-a como resultado de CI para os arquivos de resultado de saída.
Clique duas vezes na imagem de exibição dupla. Arquivo MB escrito no software de análise de dados e insira os caminhos de arquivo para a pasta de resultado de CI na pasta com o arquivo BMP. Empurre as teclas de mudança e retorno simultaneamente para iniciar uma análise automática, que usa o valor de uma região de intensidade máxima na imagem RFP tag.
Finalmente, verifique se os arquivos de saída são criados adequadamente na pasta de resultado de CI. Na análise representativa, os dados do canal GCaMP e tag RFP foram obtidos como uma série de imagens. O deslocamento da placa de Petri induzida pelo sistema de vibração não localizado também foi quantificado.
O deslocamento pode ser controlado definindo o valor de amplitude no software para controle de vibração, e o ajustador de volume e o amplificador. Considerando que a frequência pode ser regulada definindo o valor de frequência no software. Uma resposta transitória de cálcio dos neurônios AVA foi observada após a estimulação com vibrações com uma frequência de 630 Hertz e um deslocamento de aproximadamente 4,5 micrômetros por segundo, indicando que o neurônio Ava foi ativado durante a resposta retrógrada de um verme à estimulação não localizada.
Em nosso procedimento, podemos quantificar apenas um único neurônio. No entanto, este sistema também pode ser combinado com um método de imagem biométrica para quantificar sem invasivamente múltiplos neurônios ou até mesmo todo o cérebro.
