Наша система позволяет исследователям вызывать нелокализованные вибрации с хорошо контролируемыми свойствами при немасштабируемом смещении и количественно оценивать ток кальция во время реакций раздражителей на вибрации. В качестве основного преимущества этой техники мы можем неинвазивно исследовать нейронные механизмы, лежащие в основе механизмов поведения. Подготовьте новую среду для роста нематоды или пластину NGM, на которой Escherichia coli OP50 нанесена в квадратном виде с использованием клеточного распределителя, чтобы червь проводил большую часть времени в бактериях во время визуализации кальция.
За четыре дня до эксперимента по визуализации кальция перенесите двух взрослых червей ST12 на пластину и поместите пластину в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия на четыре дня. Выполняйте кальциевую визуализацию с помощью микроскопа, оснащенного акустическим преобразователем для стимуляции, объективом 2x, высокоскоростной КМОП-камерой, оптикой для разделения изображения. Включите прецизионный компьютер в контроллере моторизованной ступени X Y.
Затем включите усилитель и установите регулятор громкости на 10 в базе и регуляторы высоких частот на восемь. Чтобы возбудить GCaMP и пометить RFP, включите 488 и 560-нанометровые огни светодиодного источника света. Установите 470 и 550 нанометровые датчики модуля управления в источнике света на 5%, чтобы интенсивность светодиодного света подходила для визуализации.
Загрузите и установите следующие пакеты программного обеспечения и windows. Программное обеспечение для макросов мыши, программное обеспечение для контроля вибрации, программное обеспечение для отслеживания запуска и программное обеспечение для анализа данных. Дважды щелкните файл программного обеспечения для отслеживания, затем установите время экспозиции на 0,033 секунды и биннинг два на два, чтобы обеспечить плавное получение изображения.
Нажмите кнопку «Выполнить» и подождите пять минут, чтобы стабилизировать программное обеспечение. Введите информацию для получения изображения. Например, чтобы записать 500 изображений без интервала, введите 500 в поле «Всего изображений», 500 в поле изображений и ноль в поле «Интервалы».
После включения кнопки захвата разделите флуоресцентное изображение с помощью оптики разделения изображения, проецируя канал GCaMP и помечая канал RFP на две половины КМОП-камеры. Откалибруйте координаты GCaMP и пометьте RFP-каналы и сохраните настройки. Затем задайте каталог для вывода файла данных и отключите сбор.
Прочитайте анализ. текстовый файл с макросистемой мыши, чтобы курсор мыши управлялся на основе координат и расписания в этом файле и дважды щелкните по файлу программного обеспечения для управления вибрацией. Установите координаты курсора мыши во время ожидания до стимуляции после начала записи, затем установите значения частоты и амплитуды в программном обеспечении для контроля вибрации.
Перенесите одного червя, экспрессирующего как GCaMP, так и метку RFP с инкубированной пластины на свежую пластину NGM, где E coli OP50 был покрыт полосами. Прикрепите пластину NGM к акустическому преобразователю с помощью прозрачной клейкой ленты. Для визуализации кальция включите кнопку сбора и найдите червя с увеличением в 2,5 раза.
Установите поле зрения 1,1 на 1,1 миллиметра с разрешением 2,6 мкм на пиксель. Выключите яркий свет и нажмите на кнопку самонаведения, чтобы отследить флуоресцентное пятно червя, которое инициирует движение ступени X Y, чтобы сохранить область максимальной интенсивности червя в середине поля зрения в теге RFP изображения. Убедитесь, что значения интенсивности равны приблизительно 1000.
Если нет, тонкая настройка 470 и 550 нанометровых датчиков модуля управления в источнике света. Нажмите кнопку «Выполнить» в макросистеме мыши, чтобы разрешить управление курсором мыши, и убедитесь, что выходной BMP-файл создан надлежащим образом. Для анализа данных создайте папку на рабочем столе и назовите ее Calcium Imaging», затем создайте папку внутри папки Calcium Imaging и назовите ее результатом CI для выходных файлов результатов.
Дважды щелкните изображение с двойным видом. MB файл написан в программном обеспечении для анализа данных, и вставьте пути к файлам в папку результатов CI в папке с BMP-файлом. Одновременно нажмите клавиши shift и return, чтобы начать автоматический анализ, который использует значение области максимальной интенсивности в теге RFP изображения.
Наконец, проверьте, правильно ли созданы выходные файлы в папке результатов CI. В репрезентативном анализе данные канала GCaMP и тега RFP были получены в виде серии изображений. Смещение чашки Петри, вызванное нелокализованной вибрационной системой, также было количественно определено.
Рабочим объемом можно управлять, установив значение амплитуды в программном обеспечении для контроля вибрации, а также регуляторе громкости и усилителе. В то время как частоту можно регулировать, устанавливая значение частоты в программном обеспечении. Переходный кальциевый ответ нейронов AVA наблюдался при стимуляции с вибрациями, имеющими частоту 630 Гц и смещение примерно 4,5 микрометра в секунду, что указывает на то, что нейрон Ava был активирован во время обратной реакции червя на нелокализованную стимуляцию.
В нашей процедуре мы можем количественно оценить только один нейрон. Тем не менее, эта система также может быть объединена с биометрическим методом визуализации для неинвазивной количественной оценки нескольких нейронов или даже всего мозга.
