最近的研究强调了血管生成和同情性创新在肥胖发展过程中脂肪组织重塑的关键作用。在这里，我们演示了一种经过修改的免疫荧光法，该方法能有效地将血管和神经纤维用于脂肪组织。我们的方法是直截了当和高效的，在长期效率和质量上不妥协。
我们使用共和显微镜获取图像。图像的高分辨率使我们能够重建血管网络并准确分析其特征。开始这个程序与麻醉和灌注六周C57黑-6J雄性小鼠，详见文本协议。
从小鼠身上解剖白色和棕色脂肪问题。用剪刀把组织样品切成小块。用消毒的钳子将小块转移到组织嵌入的盒式磁带中，并正确标记盒上的组织样本。
将含有组织样本的嵌入式盒式磁带浸入固定溶液中，温度为 4 摄氏度，24 至 48 小时。将小块消毒的钳子转移到培养皿中。用刷子 1x PBS 缓冲液清洗样品 3 次，每次洗涤 0.5 毫升。
现在，用消毒剪刀将固定组织样本切成大约两立方毫米的立方体。对于渗透，将样品转移到含有 1%Triton PBS 缓冲液的 1.5 毫升管中，并在室温下以 18 RPM 轻轻旋转管 1 小时。一小时后，通过吸气将 1x PBS 直接添加到同一管中，小心地取出 1%Triton PBS 缓冲液，将样品洗涤三次。
每次洗涤时，多次反转管子。对于阻塞，在样品中加入0.5毫升的阻格缓冲液，并在室温下培养箱，温和旋转两小时。为了准备0.4毫升的原抗体溶液，稀释两微升的抗内多莫辛和两微升的抗酪氨酸羟基乳胶抗体，直到396微升的阻尼缓冲液。
漩涡和旋转下来，以恢复音量。现在，小心地从组织块中去除阻塞缓冲液。将100微升的已准备好的原抗体溶液加入管子，并在四度摄氏度下孵育过夜。
第二天，仔细收集原抗体溶液，以便根据需要重复使用。每次洗涤 500 微升时用 1 倍 PBST 将样品洗涤三次，持续 30 分钟，以 18 RPM 的温和旋转。为制备二次抗体溶液，将两微升面粉-面粉结合抗神IGGG稀释为两微升面粉-面粉结合抗狂犬病IGG，稀释成396微升的阻尼缓冲液。
漩涡和旋转短暂收集所有的液体。现在，从样品中卸下最后一个洗涤缓冲液。在管中加入100微升的二次抗体溶液。
在室温下孵育样品两小时，在 18 RPM 下温和旋转。小心去除二次抗体溶液后，用 1x PBST 洗涤样品三次，每次洗涤 500 微升，每次洗涤 30 分钟，每次以 18 RPM 的温和旋转。对于光学间隙，将样品浸入 90%甘油的一毫升中，并在黑暗中将样品保持四度摄氏度，直到其变得透明。
在此向幻灯片中添加硅隔离器，以创建用于体积成像的井。保持硅胶的高度达到或略低于样品的高度。小心地将样品转移到井中，并用安装介质填充。
将盖玻片放在表面上，用高粘度介质密封盖玻片的季度。让安装介质在室温和黑暗下固化 24 小时。固化完成后，完全密封盖玻片的边缘，以获得最佳的样品寿命。
使用共体显微镜及其相应软件的 20 倍目标获取 Z 堆栈图像。启动系统。单击配置选项卡并激活 Argon 激光器和 He-Ne 633 激光器。
单击获取选项卡。在可见激光线面板中，向上移动相应的强度滑块，以选择高达 488 纳米和 633 纳米的激光线。最初，强度可以设置为 20 到 30%现在选择 488， 561， 633 三重双色镜。
单击活动复选框激活照片乘法器。选择光电倍增器用于 488 纳米激光器施加的发射，选择 633 纳米激光的光电倍增器 34。将光倍增器 1 的波长范围设置为 500 到 550 纳米。
在650至750纳米，为照片乘数三。通过双击每个照片倍增器旁边的彩色矩形，然后从弹出式菜单中选择颜色，选择要用于图像显示的伪颜色。现在单击实时查看示例的图像。
使用 Z 位置 nob 选择感兴趣 XY 区域内的焦点平面。通过转动激光强度、智能增益和偏移来调整图像的亮度。对于每个荧光通道，在快速查找表显示模式下执行此调整。
单击快速查找表按钮以进入快速查找表模式，其中饱和像素以蓝色显示，以帮助设置适当的亮度级别。单击两次快速查找表按钮以返回伪彩色显示模式。扫描时，顺时针将 Z 位置 nob 旋转，将焦点平面移动到感兴趣体积的一端。
然后单击结束箭头以设置扫描和位置。顺时针转动 Z 位置，通过试样将焦点平面移动到感兴趣体积的另一端。然后单击"开始"箭头以设置扫描开始位置。
将 Z 步进大小调整为 3 微米。通过选择格式 1024 由 1024、A 速度 100 Hz 和线平均值 2 来更改图像质量。选择"开始"启动 Z 堆栈图像采集 对于获取的图像堆栈的最大投影，单击"进程"选项卡然后使用工具;选择 3D 投影并在方法列表中输入最大值，而不将 X、Y 和 Z.Set 阈值更改为零，单击"应用"。
Z 卷的最大强度将堆叠到显示的 2D 图像中。要通过开源软件分析 2D 图像，请打开软件中的堆叠图像。调整容器直径和强度，直到正确选择所有容器结构。
选择运行分析，并按照软件指南导出数据。要通过许可软件分析 3D 图像，请使用该软件打开图像的原始数据。调整强度阈值和其他参数，直到 Z 体积每一层的容器结构正确分割。
骨架化生成的二进制图像堆栈，以获得一个特殊的图形。分析所选的段特征，并在软件指导下导出数据。收集了腹膜内白脂肪组织的致义区、腰椎皮下脂肪组织的中侧区域和肩内棕色脂肪组织的中侧区域。
经过整个安装染色后，组织躯干被安装并成像与共体显微镜。更多的血管被积极染色。甘油中抗内司素抗体孵化皮下白脂肪组织，表明清除步骤对血管完全染色至关重要。
为了确定使用这种方法在消胶中是否表现出不同的模式，在脂肪组织中进行公共荧光染色，并采用具有抗内多莫辛的抗体来显示血管，用抗酪氨酸羟基酶来显示神经纤维。有趣的是，结果显示，与白色脂肪组织相比，它们比棕色脂肪组织中的神经纤维的血管明显更多。在白脂肪组织中，皮下白脂肪组织表现出比表皮白脂肪组织更高的血管密度。
值得注意的是，虽然神经纤维与血管平行扩张，但它们没有表现出显著的共定位。然后用这三种脂肪组织的二D方法对容器面积、结点数和管长进行定性测量，并发现类似的结果。这种方法有效地使血管、神经纤维和脂肪组织受损。
它听起来像是研究肥胖过程中脂肪组织动态变化的有用工具。强大的口水是有毒的。请进行P-ifa涉及步骤在更广泛的皮肤接触和吸入和适当处理P-ifa因为激光束已成为焦距显微镜，但伤害眼睛。
避免眼睛暴露在来自目标的光束中，
