对蛋白质的精确定量测量对于理解蛋白质之间的动态和空间合作，以了解这种疾病回到生物学中至关重要。本实验的总体目标是为组织样本提供综合定量蛋白质解学工作流程，结合无标签和基于标签的蛋白质分析，以发现生物标志物。在这项研究中，我们使用仪器轨道疗法融合来量化蛋白质使用基于标签和无标签的方法。
组织裂解是LC-MS-MS实验成功的关键步骤之一。在珠子跳动管中取30毫克的组织。使用 PBS 清洗后，加入 300 微升尿素裂解缓冲器，其中含有 8 个摩尔尿素、Tris、NaCl 和 MgCl2。
使用探针声波器，解析组织的内容。重复此为另一个周期。如果您在管子底部观察到任何完整的组织，请在管子中加入硅珠，并使用珠子搅拌器使组织均质 90 秒，在冰上孵育 5 分钟。
在摄氏4度下将样品离心约6000G，15分钟，将细胞碎片与超高纳特分离。将超纳特收集在新鲜的管子中，并均匀地混合溶液。使用布拉德福德试剂对组织解化物中的蛋白质浓度进行量化。
为此，测量 595 纳米下样品的 OD，并使用此屏幕上显示的标准图形推断该示意器。蛋白质定量后，在12%SDS-PAGE凝胶上运行10微克组织解质，以检查解质的质量。解决方案消化的第一步是使用 TCEP 减少脱硫债券。
加入 TCEP 后，在 37 摄氏度下孵育管内物品一小时。下一步涉及烷基化，以防止减少的脱硫债券重新形成。加入像碘酰胺这样的烷基化剂，在黑暗中孵育管子10分钟。
孵化后，用四到八个量的稀释缓冲稀释尿素，将尿素的最终浓度降低到小于一摩尔。此时，建议检查 pH 值。下一步包括在管子中加入试丁二肌，并在一夜之间孵育管子以进行有效的消化。
第二天，在真空浓缩器中干燥消化的肽，然后开始脱盐步骤。要执行肽的脱盐，请使用 C18 阶段提示。通过添加 50 微升甲醇来激活 C18 阶段尖端，在 1000 G 下离心两分钟。
现在，在0.1%的富酸中加入50微升丙酮酸来清洗舞台尖端，然后再次离心尖端。在 50 微升 0.1% 的富酸中重新合成干燥消化的肽。将重组的肽添加到激活的阶段尖端。
重复此步骤至少四次。要清洗样品，加入50微升0.1%的福糖酸，并重复离心步骤。对于多肽的消解，在0.1%的原酸中加入40%ACN的50微升，并通过离心通过舞台尖端。
重复此步骤与 50% 和 60% ACN 在 0.1% 的原酸，并收集在新鲜管过滤液。使用真空浓缩器干燥脱盐肽。在 LC-MS-MS 运行之前，使用示波器方法量化肽。
为此，将两个微升重构样品装载到微滴板井中，测量 205 纳米和 280 纳米的吸气量。计算此幻灯片上描述的公式的浓度。干燥后，脱盐肽就已准备好进行基于标签的量化。
对于 iTRAQ 标签，必须在 iTRAQ 标签套件中提供的 20 微升溶解缓冲器中重新构用干肽。通过添加套件中提供的小瓶中的乙醇来重组标签，并彻底混合。建议所有步骤都根据制造商的说明执行。
将同质混合的 iTRAQ 标签添加到各自的管子中，并允许发生标签反应。反应结束时，通过添加MS级水来淬火管中多余的未绑定标签，并孵育半小时至一小时。现在，将所有标记的内容转移到一个管子中，并干燥标记的肽。
在将样品重新制造成0.1%的富酸后，打开NanoLC的自动采样器，并将样品放入自动采样器内。样品一旦放入自动采样器中，就必须为液相色谱和质谱设置正确的参数。在这里，我们使用 LC-MS 描述无标签量化和基于 iTRAQ 的量化参数。
在无标签量化的情况下，120 分钟的梯度被用作正在注射的单个未违规样品。根据样本的复杂性，可以增加或减少此持续时间。在这个实验中，每分钟300纳罗利特的流量被设置为解决方案B的以下梯度，在这种情况下，1%的甲基丙酮酸为80%。
同样，我们可以为 iTRAQ 实验设置梯度。由于样品未违规，已使用 90 分钟的梯度。可在此处看到无标签量化以及基于 iTRAQ 标签的量化的 MS 参数。
第一步是通过单击全球参数来设置应用模式。选择肽模式，并根据使用的LC梯度设置方法持续时间。定义实验的扫描参数。
单击 MS-OT 选项后，参数将变得可见。正在使用的探测器类型设置为轨道疗法。此仪器上可用的另一个选项包括离子陷阱。
该分辨率已设定为 60，000，根据实验的需要和类型，人们可能会在可用的不同选项之间做出选择。质量范围正常，扫描范围设置为 375 到 1700。其他参数为 MS 应用程序默认值。
强度阈值已设置，充电状态设置在 2 到 6 的范围。动态排除已设置为 40 秒，质量容差已保持为 10。下一组参数包括 MS-MS 参数。
选择隔离模式时，选择四极，隔离窗口设置为2个，隔离偏移设置为关闭，激活类型通常是用于蛋白体学实验的HCD。碰撞能量可以修复，也可以辅助。标记的样品需要更高的碰撞能量，因此，对于 iTRAQ 实验，建议将碰撞能量设置为 35，而对于 LFQ 实验，则可设置为 30。
此处使用的探测器类型是轨道疗法。扫描范围模式将是自动的。其他参数为 iTRAQ 实验和无标签定量实验的默认值。
单击摘要将概述用于实验的所有 LC 和 MS 参数。您可以查看每个参数并进行校对。完成后，然后单击该文件并将其保存为方法文件。
保存后，您可以运行该方法，并且将获取原始文件。然后，这些原始文件可以使用蛋白质组发现者软件进行分析。此图显示了 BSA 在三个技术复制中的序列覆盖率，在三个复制中为 91%。
这表明仪器的可重复性。现在，这个数字显示了三种不同的生物样本中识别的肽光谱匹配、肽和蛋白质数量的均匀性，这再次说明了仪器的可重复性。在这里，Venn 图表示在无标签实验和基于标签的实验中在三个不同的样本中识别的常见和排他性蛋白质。
这些条形图显示了在LFQ和iTRAQ实验中识别的1%FDR后肽光谱匹配数、肽组、总蛋白质、蛋白质组和蛋白质数。生物样本的组织蛋白解学使我们能够探索与疾病进展的不同阶段相关的新的潜在生物标志物。所述的组织定量蛋白体分析协议提供了可重复的良好覆盖数据。
使用技术复制确保良好的可重复性，即使样品是在不同的时间点运行。在这里，我们展示了使用两种量化方法对组织样本的分析：无标签和基于标签的蛋白术。定量蛋白技术的选择可能取决于样本数量、MS平台的可用性和需要解决的生物问题。
