所提出的方案允许量化动物组织中广泛的脂质。它是研究脂质机制以及识别动物模型中指示早期毒性的生物标志物的简单工具。该方法可在各种样品基质中提供 14 种不同脂质类别的 400 多种分子脂质的定量分析，每个样品的趋势时间为 10 分钟。
首先，用碳酸氢铵缓冲液稀释等分试样等分1上清液浓度的两倍。制备牛血清白蛋白标准曲线后，涡旋标准管并在室温下以18，200g离心管15秒。从先前制备的标准管中，将空白，标准品和样品各转移6微升到96孔平底板上。
接下来，使用多通道移液器和混合物向每个孔中加入 250 微升 Bradford 试剂。孵育5分钟后，使用酶标仪测量595纳米波长的吸光度。将装有100微升碳酸氢铵溶液的2毫升管准备到总空白和内标空白的每个管中，并将所有样品放在冰上。
准备质量控制样品，考虑到在每组 10 个样品之间放置一个质量控制样品。将 10 μL 混合的人血浆加入 2 毫升试管中，然后将 10 μL 内标溶液加标到所有内标空白、质控和研究样品中。向每个样品中加入300微升零下20摄氏度的丁醇甲醇混合物，并在室温下在恒温下在热混合器上以450g摇动10分钟。
接下来，加入300微升庚烷乙酸乙酯混合物，在室温下在恒温下以450g摇晃10分钟，然后加入300微升1%苦行酸混合物，在室温下在恒温下摇晃5分钟在温度上。在室温下以2，800g离心5分钟，并将360微升上相转移到标记为2的新2毫升自锁管中。将320微升庚烷乙酸乙酯加入标记为1的水相管后，在室温下在恒温下以450g摇动5分钟，然后在室温下以2， 800g离心5分钟如前所述。
转移320微升上相，并将它们与管2中上一步的馏分混合。同样，将250微升庚烷乙酸乙酯加入管1中的水相中，并在室温下在恒温下摇动5分钟。再次，在室温下以2， 800g离心5分钟，然后转移200微升上相并将其与管2中先前步骤的馏分混合。
在真空浓缩器中蒸发至35摄氏度干，并重新溶解在300微升MS混合物溶液中。涡旋每个试管5秒钟以确保所有东西都溶解，并在18，200g下在4摄氏度下离心5分钟。将50微升的等分试样转移到微升板中进行正电离模式分析，并用50微升MS混合物溶液稀释。
再次，用80微升MS混合物稀释，并将20微升的等分试样转移到MTP板中进行负电离模式分析。分析前用箔纸包裹板并保持在4摄氏度。在分析前 5 天或更短时间内按照制造商的说明在正负模式下校准 MS。
预先安装直接输注纳米源，确保其与MS的转移毛细管和4.1微米喷嘴芯片正确对齐到芯片支架中，然后检查正负输注参数对应于1.25 psi的气体压力，1.1 kV的源电压，5微升的样品进样量， 输出触点闭合Rel12.5秒，5分钟交货时间，板冷却在4摄氏度，然后设置温度控制器并创建一个新板。对于正模式，请检查并调整软件是否将MS方法设置为250摄氏度的毛细管温度，S透镜RF电平设置为65.0。在Xcalibur软件中，打开阳性方法并检查全扫描MS采集是否设置为0至1分钟，在550至1， 000 m/z范围内，分辨率为140， 000，自动增益控制为100万，最大进样时间为50毫秒。
应用锁定质量 680.48022。检查数据无关的MS/MS采集方法是否设置在1和5分钟的时间范围内，分辨率为17， 500，固定的第一质量为250 m/z。检查 MS2 的自动增益控制是否设置为 100， 000，最大注入时间为 64 毫秒，碰撞能量是否为 20 NCE，隔离窗口是否设置为 1 m/z，并且使用的质量步长为 1 道尔顿的夹杂物质量列表从 398 到 1， 100 m/z。
对于负模式下的采集，请在调谐软件中检查MS方法是否设置为250摄氏度，S透镜RF电平为65.0。接下来，在Xcalibur软件中，检查全扫描采集模式是否设置为从0到1分钟，分辨率为140， 000，覆盖400至940 m/z范围，自动增益控制为100万，最大注入时间为200毫秒，锁定质量为526.46262。检查 DIA 模式下的 MS2 采集是否在运行 1 到 5 分钟之间设置，分辨率为 17， 500，固定第一质量为 150 m/z，自动增益控制为 100， 000，最大注入时间为 64 毫秒，碰撞能量为 35 NCE，夹杂物质量列表从 400 到 940，质量步长为 1 道尔顿。
在Xcalibur软件中以正模式创建分析序列队列并触发它，然后在ChipSoft软件中创建序列并开始分析，同时等待来自每个样品的直接输液机器人的接触闭合信号触发样品采集。正模式分析完成后，在Xcalibur软件中创建负模式的分析序列队列并触发它，然后在ChipSoft软件中创建序列并开始分析，同时等待样品采集由来自直接输液机器人的接触闭合信号触发每个样品。从 14 种最丰富的脂质类别中鉴定并量化总归一化脂质浓度，PE、PEO、PC、PCO、PI 和 PG 脂质类别略有升高，SM、LPE 和 PA 脂质观察到一些下调。
虽然TAG和PS没有区别。这些结果还表明，在基于总分子式的分子特征中，100至120种化合物受到香烟烟雾暴露的显着影响。MS2片段的反卷积和片段信号强度的归一化允许近似定义每个脂质玻璃中表示的每种共轭脂肪酸的总量，并在暴露组和对照组之间比较这些数据。观察到完全饱和脂肪酸和少量不饱和脂肪酸减少，而香烟烟雾组PC，PE和PG磷脂类组合中的多不饱和脂肪酸在所有时间点均升高。
PC和PG与二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸结合的极端情况仅在3R4F CS暴露组中检测到。样品和QC样品的移液必须使用低条带吸头完成，并且要准确，这意味着必须在每个样品之间检查吸头。内标溶液的移液至关重要，必须准确。
必须小心处理1：1二氯甲烷甲醇的溶液，并且必须使用含有尖端的非增塑剂，以避免样品中含有塑料聚合物。每个样品之间必须更换吸头。
