该协议可用于灭活染色体基因以分离突变体以进行基因功能研究和细菌。它使同源重组过程简单、快速和高效。使用该技术，可以删除病原体的毒力相关基因以获得减毒突变体，该突变体可用作减毒疫苗的候选者。
首先扩增含有micC基因血学片段的氯霉素盒。设计正向和反向引物以扩增来自质粒PKD3的氯霉素盒，包括来自micC基因的五个素数和三个素数末端的50个碱基对同源性延伸。按照文本手稿中的说明进行PCR，使用PKD3质粒作为模板扩增氯霉素盒。
用琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。然后用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物，并通过分光光度法测定DNA的浓度。进行第二次PCR反应以消除PKD3质粒进一步重组的干扰。
以1比200的比例稀释第一个PCR产物，并将其用作二级PCR的模板。为了构建第一个重组菌株50336 delta micC点猫，将100微升SE 50336感受态细胞与5微升PKD 46质粒混合，并在冰上孵育30分钟。在42摄氏度下对混合物进行热冲击90秒，然后将其迅速转移回冰上两分钟，将质粒转化为细胞。
通过在氨苄西林耐药平板上以30摄氏度培养细胞过夜来筛选阳性菌落。第二天，向SE 50336 PKD 46液体培养物中再加入30毫利尔阿拉伯糖，并在振荡的同时在30摄氏度下孵育一小时诱导重组酶表达。在电击杯中混合 100 纳克纯化的 PCR 产物和 40 微升 SE 50336 PKD 46 感受态细胞。
然后进行电击改造。电转化后，将混合物转移到一毫升SOC培养基和150RPM和30摄氏度的振荡培养箱中一小时。将混合物铺在耐氯霉素的LB平板上，并在37摄氏度下培养过夜以筛查阳性菌落。
在42摄氏度下培养阳性菌落两个小时。然后在 37 摄氏度下筛选菌落对氨苄西林的敏感性和对氯霉素的耐药性过夜，以获得第一个不含 PKD 46 的重组菌株。使用PCR和凝胶电泳提取50336 Delta micC点猫基因组DNA后，将100纳克质粒PCP 20电镀成40微升50336 Delta micC点猫感受态细胞。
在 30 摄氏度的氨苄西林和氯霉素耐药平板上筛查阳性转化体。将正转化体转移到非抗性LB液体培养基中，并在42摄氏度下培养过夜。然后在 37 摄氏度的 LB 平板上分离单个菌落。
选择对氨苄西林和氯霉素敏感的菌落。这个突变体是micC缺失突变体SE 50336 Delta micC。按照文本手稿中的说明执行 PCR 验证 50336 Delta micC。
该协议用于在补充突变体50336 Delta micC，pmicC中构建缺失突变体50336 Delta micC。通过PCR验证了第一个重组50336 Delta micC点猫，插入氯霉素的预期条带大小约为1200个碱基对PCR产物，而野生型菌株的预期条带大小为279个碱基对。在第二次重组中，氯霉素盒被PCP 20消除。
PCR结果结合测序证实，同基因micC突变体构建成功。采用实时定量PCR分析了菌株50336、50336 delta micC和50336 delta micC pmicC中ompA、ompC和ompD基因的表达。与野生型菌株相比，ompA和ompC以及50336 delta micC的转录增加了约2.2倍和3倍。
而ompD的转录仅略有增加。LD 50测定显示，在用三种菌株中的每一种感染6至8周龄的BALB / c小鼠后，大多数感染50336 Delta micC的小鼠在感染后48小时表现出倦怠，食欲不振或腹泻，并在96小时后死亡。野生型菌株和50336 delta micC pmicC感染的小鼠在感染后72小时表现出相同的症状，并在120小时后死亡。
3株菌株的LD 50表明，突变体50336 Delta micC的毒力比野生型提高了2.5倍。该技术有助于研究人员研究细菌基因的功能，并通过删除靶基因获得所需的工程菌株。
