Este protocolo pode ser usado para inativar genes cromossômicos para isolar mutantes para estudo da função gênica e bactérias. Isso torna o processo de recombinação homóloga simples, rápido e altamente eficiente. Usando esta técnica, os genes relacionados à virulência do patógeno podem ser deletados para obter o mutante atenuado que pode ser usado como um candidato para a vacina atenuada.
Comece amplificando o de cloranfenicol contendo fragmentos hemológicos do gene micC. Projete primers para frente e para trás para amplificar o de cloranfenicol do plasmídeo PKD3, incluindo 50 extensões de homologia de pares de bases das cinco extremidades primos e três primos do gene micC. Realizar a PCR conforme descrito no texto manuscrito utilizando o plasmídeo PKD3 como molde para amplificar o de cloranfenicol.
Determinar o tamanho do produto da PCR com eletroforese em gel de agarose. Em seguida, purificar o produto com um kit de recuperação de gel de DNA e determinar a concentração de DNA por espectrofotometria. Realizar uma segunda reação de PCR para eliminar a interferência de recombinação adicional pelo plasmídeo PKD3.
Diluir o primeiro produto de PCR em uma proporção de 1 para 200 e usá-lo como um modelo para o PCR secundário. Para construir a primeira cepa recombinante 50336 delta micC dot cat, misture 100 microlitros de células competentes SE 50336 com cinco microlitros de plasmídeo PKD 46 e incube no gelo por 30 minutos. Choque térmico a mistura a 42 graus Celsius por 90 segundos e transferi-la rapidamente de volta ao gelo por dois minutos para transformar o plasmídeo nas células.
Rastreie colônias positivas cultivando as células durante a noite a 30 graus Celsius em uma placa resistente à ampicilina. No dia seguinte, adicionar mais 30 mili de L arabinose à cultura líquida SE 50336 PKD 46 e induzir a expressão da recombinase com uma hora de incubação a 30 graus Celsius enquanto agita. Misture 100 nanogramas do produto de PCR purificado e 40 microlitros de células competentes SE 50336 PKD 46 em um copo de choque elétrico.
Em seguida, realize a transformação do choque elétrico. Após a eletrotransformação, transferir a mistura para um mililitro de meio SOC e uma incubadora de cultura de agitação a 150 RPM e 30 graus Celsius por uma hora. Espalhe a mistura em uma placa LB resistente ao cloranfenicol e cultive a 37 graus Celsius durante a noite para rastrear colônias positivas.
Cultivar as colônias positivas a 42 graus Celsius por duas horas. Em seguida, rastreie a colônia quanto à sensibilidade à ampicilina e resistência ao cloranfenicol a 37 graus Celsius durante a noite para obter a primeira cepa recombinante sem PKD 46. Depois de extrair o DNA genômico do gato do ponto micC 50336 Delta micC usando PCR e eletroforese em gel, eletroplaca 100 nanogramas de PCP 20 plasmidial em 40 microlitros de 50336 células competentes do gato do ponto micC do delta.
Filtre transformadores positivos em placas resistentes à ampicilina e ao cloranfenicol a 30 graus Celsius. Transfira os transformadores positivos para meio líquido LB não resistente e cultive-os durante a noite a 42 graus Celsius. Em seguida, isole colônias únicas em uma placa LB a 37 graus Celsius.
Selecione a colônia que é sensível à ampicilina e ao cloranfenicol. Este mutante é o mutante de deleção micC SE 50336 Delta micC. Verifique 50336 Delta micC realizando PCR conforme descrito no manuscrito do texto.
Este protocolo foi usado para construir o mutante de deleção 50336 Delta micC no mutante complementado 50336 Delta micC, pmicC. O primeiro gato de ponto recombinante 50336 Delta micC foi validado por PCR com um tamanho de banda esperado de cerca de 1200 pares de bases de produtos de PCR com a inserção de cloranfenicol em comparação com 279 pares de bases na cepa selvagem. Na segunda recombinação, o de cloranfenicol foi eliminado pela PCP 20.
Os resultados da PCR combinados com o sequenciamento confirmaram que o mutante isogênico micC foi construído com sucesso. A expressão dos genes ompA, ompC e ompD nas linhagens 50336, 50336 Delta micC e 50336 delta micC pmicC foi analisada por PCR quantitativo em tempo real. A transcrição de ompA e ompC e 50336 delta micC aumentou cerca de 2,2 vezes e três vezes em comparação com a cepa selvagem.
Enquanto a transcrição de ompD aumentou apenas ligeiramente. Os ensaios LD 50 mostraram que, depois de infectar camundongos BALB/c de seis a oito semanas de idade com cada uma das três cepas, a maioria dos camundongos infectados por 50336 Delta micC apresentou lassidão, inapetência ou diarreia 48 horas após a infecção e morreu após 96 horas. Os camundongos infectados pela cepa selvagem e 50336 delta micC pmicC apresentaram os mesmos sintomas 72 horas após a infecção e morreram após 120 horas.
A LD 50s das três cepas indicou que a virulência do mutante 50336 Delta micC aumentou 2,5 vezes em comparação com o tipo selvagem. Essa técnica ajuda os pesquisadores a estudar a função dos genes bacterianos e obter a cepa projetada desejada excluindo os genes-alvo.
