פרוטוקול זה יכול לשמש להשבתת גנים כרומוזומליים כדי לבודד מוטנטים לחקר תפקודי גנים וחיידקים. זה הופך את תהליך הרקומבינציה ההומולוגית לפשוט, מהיר ויעיל ביותר. באמצעות טכניקה זו, ניתן למחוק את הגנים הקשורים לאלימות של הפתוגן כדי להשיג את המוטציה המוחלשת אשר יכולה לשמש כמועמד לחיסון מוחלש.
התחל על ידי הגברת קלטת chloramphenicol המכילה קטעי hemology של הגן micC. תכננו פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את קסטת הכלוראמפניקול מפלסמיד PKD3, כולל 50 הרחבות הומולוגיה של זוג בסיסים מחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים של הגן micC. בצע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט באמצעות פלסמיד PKD3 כתבנית להגברת קלטת כלורמפניקול.
לקבוע את הגודל של מוצר PCR עם אלקטרופורזה ג'ל agarose. לאחר מכן לטהר את המוצר עם ערכת התאוששות ג'ל DNA ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטריה. בצע תגובת PCR שנייה כדי למנוע את ההפרעה של רקומבינציה נוספת על ידי פלסמיד PKD3.
לדלל את מוצר ה- PCR הראשון ביחס של 1 עד 200 ולהשתמש בו כתבנית עבור PCR משני. כדי לבנות את הזן הרקומביננטי הראשון 50336 delta micC dot cat, ערבבו 100 מיקרוליטר של תאים מוסמכים SE 50336 עם חמישה מיקרוליטרים של פלסמיד PKD 46 ודגרו על קרח במשך 30 דקות. מחממים את התערובת בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ומעבירים אותה במהירות חזרה על קרח למשך שתי דקות כדי להפוך את הפלסמיד לתאים.
מסך מושבות חיוביות על ידי תרבית התאים במשך הלילה ב 30 מעלות צלזיוס על צלחת עמידה אמפיצילין. למחרת, הוסיפו 30 מילי ליטר ארבינוז נוספים לתרבית הנוזלית SE 50336 PKD 46 וגרמו לביטוי רקומבינאז עם דגירה של שעה ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה. ערבבו 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר ו-40 מיקרוליטר של SE 50336 PKD 46 תאים מוסמכים בכוס הלם חשמלי.
לאחר מכן לבצע טרנספורמציה הלם חשמלי. לאחר טרנספורמציה חשמלית, מעבירים את התערובת למיליליטר אחד של מדיום SOC ואינקובטור תרבית מטלטלת ב-150 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס למשך שעה. מורחים את התערובת על צלחת LB עמידה לכלוראמפניקול ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לסנן מושבות חיוביות.
תרבית את המושבות החיוביות ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן בדקו את המושבה לרגישות לאמפיצילין ועמידות לכלורמפניקול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקבל את הזן הרקומביננטי הראשון ללא PKD 46. לאחר חילוץ הדנ"א הגנומי של החתול 50336 Delta micC dot באמצעות אלקטרופורזה של PCR וג'ל, אלקטרופלטה 100 ננוגרם של פלסמיד PCP 20 לתוך 40 מיקרוליטר של 50336 תאים מוסמכים של Delta micC dot cat.
שנאי מסך חיוביים על לוחות עמידים בפני אמפיצילין וכלוראמפניקול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. מעבירים את הטרנספורמטורים החיוביים למדיום נוזלי LB שאינו עמיד ומתרבתים אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בודדו מושבות בודדות על צלחת LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
בחר את המושבה הרגישה הן אמפיצילין ו chloramphenicol. מוטנט זה הוא מוטנט מחיקת micC SE 50336 Delta micC. אמת 50336 Delta micC על ידי ביצוע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט.
פרוטוקול זה שימש לבניית מוטנט המחיקה 50336 Delta micC במוטנט המחמאה 50336 Delta micC, pmicC. חתול הנקודות הרקומביננטי הראשון 50336 Delta micC דוט חתול אומת על ידי PCR עם גודל פס צפוי של כ -1200 זוגות בסיסים של מוצרי PCR עם החדרת כלוראמפניקול בהשוואה ל -279 זוגות בסיסים בזן מסוג פראי. ברקומבינציה השנייה, קלטת chloramphenicol בוטל על ידי PCP 20.
תוצאות ה-PCR בשילוב עם ריצוף אישרו כי מוטציית micC איזוגנית נבנתה בהצלחה. ביטוי הגנים ompA, ompC ו-ompD בזנים 50336, 50336 Delta micC ו-50336 delta micC pmicC נותחו על ידי PCR כמותי בזמן אמת. התעתיק של ompA ו-ompC ו-50336 delta micC גדל בערך פי 2.2 ופי שלושה בהשוואה לזן מסוג Wild.
בעוד תמלול של ompD רק גדל מעט. בדיקות LD 50 הראו כי לאחר שהדביקו עכברי BALB/c בני שישה עד שמונה שבועות בכל אחד משלושת הזנים, רוב העכברים שנדבקו במיקרופון דלתא 50336 הפגינו רפיון, חוסר יכולת או שלשול 48 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 96 שעות. העכברים שנדבקו בזן פראי וב-50336 delta micC pmicC הציגו את אותם תסמינים 72 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 120 שעות.
ה-LD 50s מבין שלושת הזנים הצביע על כך שהאלימות של ה-50336 Delta micC המוטנטי השתפרה פי 2.5 בהשוואה לסוג הפראי. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לחקור את תפקודם של גנים חיידקיים ולהשיג את הזן המהונדס הרצוי על ידי מחיקת גני מטרה.
