이 프로토콜은 유전자 기능 연구 및 박테리아를 위한 돌연변이를 분리하기 위해 염색체 유전자를 비활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 상동 재조합 과정을 간단하고 빠르며 매우 효율적으로 만듭니다. 이 기술을 사용하여 병원체의 독성 관련 유전자를 결실하여 약독화 백신의 후보로 사용할 수 있는 약독화 돌연변이를 얻을 수 있습니다.
micC 유전자의 헤모로지 단편을 함유하는 클로람페니콜 카세트를 증폭하는 것으로 시작한다. micC 유전자의 5개 프라임 말단과 3개의 프라임 말단에서 50개의 염기쌍 상동성 확장을 포함하여 플라스미드 PKD3에서 클로람페니콜 카세트를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. PKD3 플라스미드를 주형으로 사용하여 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하여 클로람페니콜 카세트를 증폭한다.
아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물의 크기를 결정합니다. 그런 다음 DNA 겔 회수 키트로 제품을 정제하고 분광 광도계로 DNA 농도를 결정합니다. PKD3 플라스미드에 의한 추가 재조합의 간섭을 제거하기 위해 두 번째 PCR 반응을 수행합니다.
첫 번째 PCR 산물을 1 : 200의 비율로 희석하여 2차 PCR의 주형으로 사용합니다. 첫 번째 재조합 균주 50336 델타 micC 도트 캣을 구성하기 위해, 100 마이크로리터의 SE 50336 컴피턴트 세포와 5 마이크로리터의 PKD 46 플라스미드를 혼합하고, 30분 동안 얼음 상에서 배양한다. 혼합물을 섭씨 42도에서 90초 동안 열 충격을 가하고 2분 동안 얼음 위에서 빠르게 다시 옮겨 플라스미드를 세포로 변형시킵니다.
암피실린 내성 플레이트에서 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다. 다음날, SE 50336 PKD 46 액체 배양액에 30 밀리 L 아라비노스를 더 첨가하고 진탕하면서 섭씨 30도에서 1시간 배양하여 재조합효소 발현을 유도한다. 정제된 PCR 산물 100나노그램과 SE 50336 PKD 46 컴피턴트 셀 40마이크로리터를 전기 충격 컵에 혼합합니다.
그런 다음 감전 변환을 수행하십시오. 전기변환 후, 혼합물을 1밀리리터의 SOC 배지로 옮기고 150RPM 및 섭씨 30도에서 1시간 동안 진탕 배양 배양기에서 배양한다. 혼합물을 클로람페니콜 내성 LB 플레이트에 바르고 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
양성 콜로니를 섭씨 42도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 암피실린에 대한 민감성 및 클로람페니콜에 대한 내성에 대해 콜로니를 섭씨 37도에서 밤새 스크리닝하여 PKD 46이 없는 첫 번째 재조합 균주를 얻습니다. PCR 및 겔 전기영동을 이용하여 50336 델타 micC 도트 캣 게놈 DNA를 추출한 후, 100 나노그램의 플라스미드 PCP 20을 40 마이크로리터의 50336 델타 micC 도트 캣 컴피턴트 세포에 전기도금하였다.
섭씨 30도에서 암피실린과 클로람페니콜 내성 플레이트 모두에서 양성 형질전환체를 스크리닝합니다. 양성 형질전환체를 비내성 LB 액체 배지로 옮기고 섭씨 42도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 LB 플레이트에서 단일 콜로니를 분리합니다.
암피실린과 클로람페니콜 모두에 민감한 식민지를 선택하십시오. 이 변이체는 micC 델타 SE 50336 결실 변이체 micC이다. 텍스트 원고에 설명된 대로 PCR을 수행하여 50336 Delta micC를 확인합니다.
이 프로토콜은 보완된 돌연변이 50336 델타 micC, pmicC에서 결실 돌연변이 50336 델타 micC를 구축하는데 사용되었다. 최초의 재조합 50336 델타 micC 도트 캣은 야생형 균주의 279개 염기쌍과 비교하여 클로람페니콜이 삽입된 PCR 산물의 약 1200개 염기쌍의 예상 밴드 크기를 갖는 PCR에 의해 검증되었습니다. 두 번째 재조합에서, 클로람페니콜 카세트는 PCP 20에 의해 제거되었다.
염기서열 분석과 결합된 PCR 결과는 동종 micC 돌연변이가 성공적으로 구성되었음을 확인했습니다. 균주 50336, 50336 Delta micC 및 50336 delta micC pmicC에서 ompA, ompC 및 ompD 유전자의 발현을 실시간 정량적 PCR로 분석했습니다. ompA 및 ompC 및 50336 델타 micC의 전사는 야생형 균주에 비해 약 2.2배 및 3배 증가하였다.
ompD의 전사는 약간만 증가했습니다. LD 50 분석에 따르면 6 내지 8주령 BALB/c 마우스를 3개의 균주 각각으로 감염시킨 후, 50336 Delta micC에 감염된 대부분의 마우스는 감염 후 48시간 후에 권태감, 식욕 부진 또는 설사를 나타내고 96시간 후에 사망하는 것으로 나타났다. 야생형 균주 50336 델타 micC와 pmicC에 의해 감염된 마우스는 감염 후 72시간 후에 동일한 증상을 나타내었고 120시간 후에 사망하였다.
3개 균주의 LD50s는 돌연변이체 50336 델타 micC의 독성이 야생형에 비해 2.5배 향상되었음을 나타내었다. 이 기술은 연구자들이 박테리아 유전자의 기능을 연구하고 표적 유전자를 삭제하여 원하는 조작된 균주를 얻는 데 도움이 됩니다.
