Dieses Protokoll kann zur Inaktivierung chromosomaler Gene verwendet werden, um Mutanten für Genfunktionsuntersuchungen und Bakterien zu isolieren. Es macht den homologen Rekombinationsprozess einfach, schnell und hocheffizient. Mit dieser Technik können die virulenzbezogenen Gene des Erregers gelöscht werden, um die abgeschwächte Mutante zu erhalten, die als Kandidat für den abgeschwächten Impfstoff verwendet werden kann.
Beginnen Sie mit der Amplifikation der Chloramphenicol-Kassette mit hämologischen Fragmenten des micC-Gens. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer zur Amplifikation der Chloramphenicol-Kassette aus dem Plasmid PKD3, einschließlich 50 Basenpaar-Homologieverlängerungen von den fünf Prime- und drei Prime-Enden des micC-Gens. Führen Sie eine PCR durch, wie im Textmanuskript beschrieben, wobei das PKD3-Plasmid als Vorlage verwendet wird, um die Chloramphenicol-Kassette zu amplifizieren.
Bestimmen Sie die Größe des PCR-Produkts mit Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen Sie dann das Produkt mit einem DNA-Gel-Rückgewinnungskit und bestimmen Sie die DNA-Konzentration durch Spektrophotometrie. Führen Sie eine zweite PCR-Reaktion durch, um die Interferenz einer weiteren Rekombination durch das PKD3-Plasmid zu eliminieren.
Verdünnen Sie das erste PCR-Produkt im Verhältnis 1 zu 200 und verwenden Sie es als Vorlage für die sekundäre PCR. Um den ersten rekombinanten Stamm 50336 delta micC dot cat zu konstruieren, werden 100 Mikroliter SE 50336 kompetente Zellen mit fünf Mikrolitern PKD 46 Plasmid gemischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für 90 Sekunden und schnell wieder auf Eis für zwei Minuten, um das Plasmid in die Zellen umzuwandeln.
Screenen Sie positive Kolonien, indem Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einer ampicillinresistenten Platte kultivieren. Am nächsten Tag geben Sie weitere 30 Milli L Arabinose in die SE 50336 PKD 46 Flüssigkultur und induzieren die Rekombinase-Expression mit einer einstündigen Inkubation bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Mischen Sie 100 Nanogramm des gereinigten PCR-Produkts und 40 Mikroliter SE 50336 PKD 46-kompetente Zellen in einem Elektroschockbecher.
Führen Sie dann eine elektrische Schlagumwandlung durch. Nach der Elektrotransformation wird das Gemisch eine Stunde lang bei 150 U/min und 30 Grad Celsius in einen Schüttelkultur-Inkubator überführt. Verteilen Sie die Mischung auf einer Chloramphenicol-resistenten LB-Platte und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, um nach positiven Kolonien zu suchen.
Kultivieren Sie die positiven Kolonien zwei Stunden lang bei 42 Grad Celsius. Anschließend wird die Kolonie bei 37 Grad Celsius über Nacht auf Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und Resistenz gegen Chloramphenicol untersucht, um den ersten rekombinanten Stamm ohne PKD 46 zu erhalten. Nach der Extraktion der genomischen DNA von 50336 Delta micC dot cat mittels PCR und Gelelektrophorese werden 100 Nanogramm Plasmid PCP 20 in 40 Mikroliter 50336 Delta micC dot cat-kompetente Zellen galvanisiert.
Schirmen Sie positive Transformatoren sowohl auf Ampicillin- als auch auf Chloramphenicol-beständige Platten bei 30 Grad Celsius ab. Überführen Sie die positiven Transformatoren in ein nicht resistentes flüssiges LB-Medium und kultivieren Sie sie über Nacht bei 42 Grad Celsius. Isolieren Sie dann einzelne Völker auf einer LB-Platte bei 37 Grad Celsius.
Wählen Sie die Kolonie aus, die sowohl auf Ampicillin als auch auf Chloramphenicol empfindlich ist. Bei dieser Mutante handelt es sich um die micC-Deletionsmutante SE 50336 Delta micC. Verifizieren Sie 50336 Delta micC durch PCR, wie im Textmanuskript beschrieben.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Deletionsmutante 50336 Delta micC in der komplementären Mutante 50336 Delta micC, pmicC, zu konstruieren. Die erste rekombinante 50336 Delta micC dot cat wurde mittels PCR mit einer erwarteten Bandengröße von etwa 1200 Basenpaaren von PCR-Produkten mit der Chloramphenicol-Insertion im Vergleich zu 279 Basenpaaren im Wildtypstamm validiert. In der zweiten Rekombination wurde die Chloramphenicol-Kassette durch PCP 20 eliminiert.
Die PCR-Ergebnisse in Kombination mit der Sequenzierung bestätigten, dass die isogene micC-Mutante erfolgreich konstruiert wurde. Die Expression der ompA-, ompC- und ompD-Gene in den Stämmen 50336, 50336 Delta micC und 50336 delta micC pmicC wurde mittels quantitativer realtime PCR analysiert. Die Transkription von ompA und ompC sowie 50336 delta micC erhöhte sich im Vergleich zum Wildtyp-Stamm um das 2,2-fache und dreifache.
Während die Transkription von ompD nur geringfügig zunahm. LD 50-Assays zeigten, dass die meisten Mäuse, die mit 50336 Delta micC infiziert waren, nach der Infektion von sechs bis acht Wochen alten BALB/c-Mäusen mit jedem der drei Stämme 48 Stunden nach der Infektion Müdigkeit, Appetitlosigkeit oder Durchfall zeigten und nach 96 Stunden starben. Die Mäuse, die mit dem Wildtyp-Stamm und 50336 delta micC pmicC infiziert waren, zeigten 72 Stunden nach der Infektion die gleichen Symptome und starben nach 120 Stunden.
Die LD 50 der drei Stämme zeigten, dass die Virulenz der Mutante 50336 Delta micC im Vergleich zum Wildtyp um das 2,5-fache anstieg. Diese Technik hilft Forschern, die Funktion bakterieller Gene zu untersuchen und den gewünschten gentechnisch veränderten Stamm zu erhalten, indem Zielgene gelöscht werden.
