使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

研究蛋白质-蛋白质相互作用对于理解多个领域的生理过程是必不可少的。在这段视频中，我们介绍了膜上消化技术，使研究人员能够方便地对MS的结合蛋白进行全面分析。该技术的主要优点是，由于多丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，因此可以提高粗免疫沉淀物蛋白质分析的通量。

通过将抗GSP抗体与500微升磷酸酸盐缓冲液中的珠子混合，开始与磁珠结合抗体。在室温下以 50 RPM 旋转混合物一小时。然后用含有1%聚糖酸酯20的柠檬酸盐缓冲液洗三次联结珠。

根据手稿指示对转染细胞进行精做。刮盘，将利沙酸盐转移到1.5毫升试管中。然后以15，000xg的离心清除酸盐5分钟，然后收集上清液。

用500微升的柠檬酸盐缓冲液洗三次，准备未标记的磁珠。最后洗涤后，取出缓冲液，将细胞化到珠子中。在室温下以 50 RPM 旋转混合物 30 分钟。

在磁性支架上进行磁分离并收集细胞分离。要将目标蛋白与免疫球蛋白结合珠子结合，请将珠子放在磁性支架上五分钟。丢弃柠檬酸盐缓冲液并将细胞酸盐添加到珠子中。

以 50 RPM 的速度旋转混合物一小时。为了将目标蛋白与自由非靶蛋白分离，用含有1%聚糖酸20的500微升柠檬酸盐磷酸盐缓冲液洗三次珠子。最后洗涤后，加入30微升柠檬酸盐缓冲液，让珠子在室温下坐5分钟，以洗净目标蛋白质。

要准备膜，请使用手术剪刀将 PVDF 膜切割成 3 毫米 3 毫米，这些剪刀在使用前立即进行清洁。将膜片放在铝箔上，在每片中加入两到五微升乙醇。在膜完全干燥之前，将蛋白质洗出的两到五微升添加到每片，然后风干，直到膜表面变得哑光。

然后将膜转移到1.5毫升管中，并在4摄氏度下储存。如果立即使用，加入2至30微升乙醇，使它们亲水。用移液器去除乙醇，但在膜干燥之前，将200微升的DTT反应溶液完全添加到每个管中，并在56摄氏度下孵育一小时。

孵育后，用300微升的碘多乙酰胺溶液代替反应溶液，在黑暗中孵育45分钟。然后用蒸馏水洗两次膜，一次用2%的乙酰酸十分，用涡流至少洗涤十秒钟。使用与透明相关的乙酰胺可能极其危险。

执行膜上消化程序时，应始终佩戴口罩、眼镜和手套。根据手稿方向准备 trypsin，并在每个膜上加入 100 微升的 trypsin 反应溶液。在37摄氏度下孵育，用于消化。

第二天，将反应溶液转移到一个干净的1.5毫升管中，并在膜中加入100微升的洗涤液。在60摄氏度下孵育膜两小时，然后收集洗涤液，与反应溶液混合。再在膜上加入100微升的洗涤液，然后对膜进行10分钟的声波化。

然后收集洗涤液，并混合与反应溶液。用一块实验室膜盖住试管，用针头在薄膜上打小孔。使用真空浓缩器干燥溶液，将残留物溶解在 10 微升 2%甲酸中。

将管以12，000 x g离心3分钟，然后将上看液转移到样品管中。使用与纳米 LC/HPLC 系统相连的质谱仪分析样品。利用该协议，在Calpain-6相关免疫沉淀物中确定了17种蛋白质，在GP相关免疫沉淀物中确定了15种蛋白质，在两种免疫沉淀物中确定了11种蛋白质。

需要注意的是，检测至少一个高保真肽片段对于候选蛋白的阳性识别是必需的。在GP表达的脂肪以及血毒蛋白、外源蛋白和核糖体蛋白中沉淀的蛋白质从列表中被省略。用蒸馏水和2%乙酰三叶酸在试消化前清洗膜是膜上消化过程中最重要的一步。

采用这种方法，可以通过进行免疫沉淀和西印分析等实验来确认靶蛋白的共沉淀。这个简单的方法使研究人员能够通过方便和高灵敏度的分析来探索新型的蛋白质-蛋白质相互作用。