研究蛋白质和微RNA调制对脂肪细胞功能的影响的脂肪细胞培养模型

此协议使在差异化脂肪细胞中操纵蛋白质或微RNA表达来研究它们在脂肪细胞功能中的作用成为可能。这种反向转化方法是将寡核苷酸转化为小鼠3T3-L1脂肪细胞的简单、经济、高效的方法。这种方法也可以应用于区分成脂肪细胞的人类前细胞。

演示这个程序的将是梅兰妮·高德夫林，一个来自我们实验室的技术员。在 DMEM 的 100 毫米菜肴中种植 3T3-L1 成纤维细胞，不含皮鲁瓦酸、25 毫摩尔葡萄糖、10% 新生儿小腿血清和 1% 青霉素和链霉素。将盘子放在37摄氏度和7%的二氧化碳的组织培养孵化器中。

汇合两天后 改变培养基，代之以不含甲基苯丙胺的DMEM、25毫摩尔葡萄糖、10%FCS、1%青霉素和链霉素，辅以0.25毫摩尔IBMX、0.25微摩尔脱氧三聚氰胺、每毫升胰岛素5微克和10微摩尔松糖酮。将菜肴孵化两天。两天后，用不含皮鲁瓦酸的DMEM、25毫摩尔葡萄糖、10%FCS和1%的青霉素和链霉素代替培养基，每毫升胰岛素补充5微克，再孵育10微摩尔葡萄糖酮，再孵育两天。

每两天用DMEM喂养细胞，不含丙酸酯、25毫摩尔葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素，并将细胞保留在孵化器中。在转染前一天或几个小时，从库存溶液中以每毫升 1 毫克 30% 乙醇 100 微克的速度准备胶原蛋白 I 型溶液。每井加入250微升胶原蛋白，每井加入124井板，将溶液铺在井面上。

将盘子放在培养罩下没有盖子，直到胶原蛋白干燥。然后用 D- pbs 洗两次。皮佩特siRNA与改进的最低基本介质混合和孵育在室温下五分钟。

将转染试剂和改进的极小必需介质添加到 siRNA 和移液器中混合。在室温下孵育20分钟。然后将转染混合物添加到胶原蛋白涂层板的每个井中。

用 D-PBS 清洗 100 毫米培养皿中的细胞两次。在细胞中加入5倍试用素，确保用试金素覆盖整个表面。等待 30 秒，并小心地取出试金素。

在37摄氏度的孵化器中孵育培养皿5至10分钟。然后点击盘子分离细胞，避免细胞损伤。加入10毫升不含皮鲁瓦酸的DMEM、25毫摩尔葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素，以中和胰蛋白酶。

小心地上下移液，分离细胞并使细胞悬架均质化。使用马拉塞兹计数室或自动细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞浓度调整为每毫升中等0.625万细胞。每井12井板的细胞悬浮800微升种子，24井板含有转染混合物的每井细胞悬浮400微升。

在细胞培养孵化器中孵育板，24小时不打扰它们。第二天，小心地用不含皮鲁瓦酸、25毫摩尔葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素的超高纳坦代替超高纳坦，并将细胞返回孵化器。在 siRNA 或 miR 交付后检测目标击倒的典型时间点为 mRNA 24 到 48 小时，蛋白质的检测时间点为 48 到 96 小时。

功能实验可以在转染的脂肪细胞上进行，包括胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂肪素分泌、脂解和脂肪生成。染菌术细胞在转染后已证明可以保持其形态。转染两天后，脂肪细胞呈现多细胞脂质液滴，其脂质含量在转染和未转染的脂肪细胞之间没有区别。

与未受感染的腺细胞相比，各种分化标记的mRNA表达在转染细胞中保持不变。反向转染协议是有效的，因为超过 70% 的脂肪细胞被转染。在与西里平-1的siRNA转染三天后，佩里平-1的mRNA水平下降了70%，蛋白质水平下降了63%，佩里平-1表达在转染后四天也通过荧光显微镜进行了分析，发现与控制腺细胞的表达相比下降了92%。

此处显示了用微RNA模拟寡核苷酸来调节 miR-34a 表达的脂肪细胞的反向转染。miR-34a的过度表达导致VAMP2蛋白表达减少50%，3T3-L1脂肪细胞中佩里平-1的击倒导致基底脂质溶解增加，而miR-34a的过度表达导致胰岛素诱导蛋白激酶B磷酸化和葡萄糖吸收的抑制。重要的是要达到高水平的脂肪细胞分化，对新分化的脂肪细胞进行转染，并仔细监测脂肪细胞与试丁核素的处理。

转染后，可以对脂肪细胞进行功能实验，以研究蛋白质或微RNA操作对胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂肪生成和脂解的影响。