利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）的人类成熟腺细胞的分离与培养

脂肪生物学领域的一个挑战是保持文化中成熟的脂肪细胞。我们开发了一种新方法，允许研究长期的脂肪细胞在重大变化。我们的脂肪细胞培养技术允许研究细胞相互作用，并希望对糖尿病和肥胖症的新疗法的发展有用。

必须仔细遵循协议，因为有一些关键步骤会极大地影响基因质量和成熟脂肪细胞的生存能力。例如，在电镀之前，请确保已去除所有自由脂质和洗涤缓冲液，否则当刀片倒置时，脂细胞可能会脱落。接受人体皮下脂肪组织样本后，将组织放在无菌生物安全柜中，放在15厘米的培养皿中。

小体积的中199到菜。使用钳子抓住组织内的大型纤维血管，并使用一把封闭的剪刀尖的背面轻轻刮掉沿容器的脂肪以释放脂肪细胞。当所有细胞被收集后，丢弃大块纤维组织，称量修剪的脂肪。

为了进一步释放脂肪组织的细胞，将10克脂肪组织转移到一个新的15厘米的培养皿中，并使用弯曲的剪刀小心地切碎脂肪，直到它成为一个光滑的同质混合物，没有大块脂肪。当所有的脂肪都处理好后，用勺子将10毫升的碎组织转移到单独的50毫升管中，并在每个管中加入30毫升的消化缓冲液。然后将管子放在37摄氏度的摇晃培养箱中，每分钟旋转150次，30至35分钟。

当脂肪溶液是同质的，杏色，和没有大块时，消化是完整的。在消化结束时，将消化的脂肪溶液放入250微米网状过滤器中，放入一个无菌的一升烧瓶中。当整个体积的脂肪细胞悬浮液被逃避时，轻轻挤压网状过滤器，以增加脂肪细胞的产量，并在再次挤压滤芯之前用50至100毫升的洗涤缓冲液清洗过滤器。

将分离的脂肪细胞溶液转移到分离漏斗中，并添加洗涤缓冲液，直到漏斗几乎完全充满。轻轻反转漏斗几次，将脂肪细胞悬浮液与缓冲液混合，让悬浮液站立两到三分钟，直到层有明显的分离。当层分离后，打开漏斗上的喷嘴，慢慢将底部溶液插入无菌烧瓶中。

当所有胶原酶被去除后，在50毫升锥形管中收集纯化的成熟脂肪细胞溶液，然后通过离心轻轻包装细胞。然后，使用装有 18 量表针的 10 毫升注射器去除脂肪细胞悬浮液下方的剩余洗涤缓冲液，并使用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞上方的自由脂层。对于成熟脂肪细胞的播种，将可渗透膜插入组件倒置在无菌表面上，并轻轻反转包装的脂肪细胞的管子几次，以确保细胞的均匀分布。

使用宽孔移液器尖端，在每个膜上加入30个包装成熟的脂肪细胞微升。以一个平滑运动反转插入面板，使种子的脂肪细胞位于刀片的底部。将刀片板放入包含 500 至 1000 微升的 24 井板中，每井的介质达到 37 摄氏度。

然后，盖上盘子，小心地将盘子放入组织培养箱。每七天的培养，通过每个刀片的切口孔更换介质。经过一周的培养，从皮下脂肪组织分离的成熟脂肪细胞聚集物维持仅在成熟脂肪细胞中观察到的具有单眼脂滴形态的特征。

使用PPAR-GAMMA激动剂皮奥格利酮和罗西格列酮的治疗可增加PPAR-GAMMA反应基因的表达，而使用糖皮质激素受体激动剂解沙米松的治疗对这些基因没有影响。同样，糖皮质激素受体激动剂有力地驱动了糖皮质激素受体靶基因的基因表达，而PPAR-GAMMA激动剂对这些基因没有显著的影响。此外，使用PPAR-GAMMA激动剂进行7天治疗，可有力地诱导棕色脂肪特异性基因UCP1的基因表达。

我们新的体外脂肪模型可用于成熟脂肪细胞的功能研究，包括葡萄糖吸收、脂生成和脂解。有了这种新的脂肪细胞培养技术，我们已经能够证明人类成熟的白色脂肪细胞可以转化为棕色的脂肪细胞。