我们的实验室使用五叶虫来识别和描述在发育和生理平衡期间调节线粒体功能的基因和途径。此处提出的协议使用活成像和添加过氧化氢来可视化氧化损伤对成人嗜血杆菌卵巢中亚细胞结构的本地化和动力学的影响。我们经常使用成像协议来研究突变如何改变女性生殖细胞的正常线粒体定位和运动。
在我们的研究过程中，我们发现解剖或其他细胞应激器引入的压力对线粒体定位有深远的影响。作为一种控制，以确定是否一般应力，而不是实验治疗，是任何改变亚细胞结构的本地化或行为的原因。我们开发了此协议，以引入使用过氧化氢的控制应力。
在这段视频中，我们将演示过氧化氢引起的氧化损伤如何改变线粒体和核糖核蛋白Clu的分布。最适合这种实时成像技术的介质包含施耐德的Drosophila介质，其中含有15%的热灭活胎儿牛血清、0.6 X Pen-Strep和200微克每微升牛胰岛素，以下简称完整的施耐德介质。在无菌条件下进行媒体准备将确保它不会受到污染。
将内容混合好，在四度过夜。胰岛素不会完全溶解在完整的施耐德介质中，您会注意到管子底部的沉淀沉淀。使阿里报价，一定要离开这个沉淀，因为它会干扰成像。
如果存储在四度等的别名中，此解决方案可以使用一个月。为了获得最佳的女性生殖细胞成像，首先准备一个含有湿酵母膏的瓶，这是花生酱的一致性。这确保了雌性食物充足，并会产生所有卵泡发育阶段的成像。
对于最佳健康的苍蝇，收集零至一天大的女性，并与雄性一起转移到含有湿酵母酱的苍蝇食物小瓶中。确保熟睡的苍蝇不会接触酵母酱，因为它们可以坚持它。喂苍蝇三到七天，每天更换酵母酱。
确保酵母糊接触苍蝇食物，使其不会干涸。为了诱导氧化损伤，我们将使用30%过氧化氢的库存溶液，并可视化线粒体，我们将使用100毫摩尔TMRE的库存溶液。重要的是要准备新鲜的介质解决方案，因为过氧化氢容易氧化，TMRE会随着时间而降解。
就在解剖前，在施耐德的媒体上，准备了两个微摩尔过氧化氢、一个46纳米摩尔TMRE的新鲜阿利库特和一个46纳米摩尔TMRE加两个过氧化微摩尔氢的新鲜阿利库特。对于卵巢解剖，您需要两对细钳和一对电解质锐化钨针。要解剖卵巢，请在表杯中填充完整的施耐德介质，这些介质已加热到室温，然后使用钳子在介质中放置一只苍蝇。
用一对细钳轻轻抓住胸腔的苍蝇。与其他钳子，抓住后部，轻轻拉取卵巢。取出任何无关的皮质层或组织，然后将卵巢转移到含有新鲜介质的新井中。
卵巢应该仍然从周围的肌肉护套移动。使用锋利的钨针，轻轻挑出卵石，小心去除周围的肌肉护套。如果不去除肌肉护套，如这里所示，卵子会抽搐，导致图像采集问题。
一旦卵子净地解剖，如果可视化内源性标记结构，将它们以 100 微升的介质滴转移到 MatTek 菜中。如果可视化带有 TMRE 标签的线粒体，则将 100 微升 TMRE 介质滴中的卵子转移到 MatTek 盘中。卵子会沉入水滴的底部。
重要的是要练习解剖，以便尽快开始成像组织。安装卵子后，将盘子放在倒置显微镜上，并获取静止图像或简短的视频，作为治疗前条件的记录。完成后，暂停实时成像，取下盖子，并小心地添加两个微摩尔过氧化氢制备溶液中的 100 微升。
避免破坏现有介质液滴的表面或添加溶液太快，以免取代底部的卵子。更换盘盖，重新定位和重新聚焦所需的卵巢，并恢复成像。小心尽快恢复成像，因为实验治疗对时间敏感。
这里显示的仍然是电影中的图像，拍摄于过氧化氢后治疗。线粒体和雌性生殖细胞分散在整个细胞质，当苍蝇喂养良好和健康。添加过氧化氢后，氧化损伤会导致线粒体结块，治疗后最快可看到10分钟。
20分钟后，损伤导致线粒体膜潜力消散。因此，大多数线粒体褪色。在这个过程的现场电影中，线粒体可以很快地聚集起来，大多数线粒体最终会褪色。
细胞质中的脉动闪烁，特别是在周围的毛囊细胞中，看起来是TMRE添加的特征。如前所述，成像必须在添加过氧化氢后迅速进行。如图所示，如果时间过多，线粒体膜的潜力已经丧失，TMRE 标签会消散，使数据无法理解。
在这些视频静止图像中，GFP 内源性标记的 Clu 颗粒在喂养良好的女性的种质中是健壮和丰富的。添加过氧化氢后，Clu 颗粒在 10 分钟内分散。这一点在所附视频中显示。
添加过氧化氢后，Clu幸福粒子迅速扩散。我们发现这个协议是一个有用的工具，以确保准确成像线粒体和Clu幸福粒子在德罗索菲拉雌性生殖细胞的野生类型本地化。此协议应适用于广泛的实时成像研究，并可用于在固定前治疗组织。
最重要的步骤是分离出没有肌肉护套的卵石，轻轻加入过氧化氢，以免驱除卵石，并在添加过氧化氢后快速成像。我们希望您能找到一个有用的控制活成像各种亚细胞结构。谢谢你的观察，祝你的实验好运。
