私たちの研究室では、ショウジョウバエメラノガスターを使用して、開発中および生理学的恒常性の間にミトコンドリア機能を調節する遺伝子や経路を同定し、特徴付けます。ここで提示されるプロトコルは、過酸化水素を添加したライブイメージングを使用して、成人ショウジョウバエ卵巣における細胞下構造の局在およびダイナミクスに対する酸化損傷の影響を可視化する。私たちは、多くの場合、突然変異が女性の生殖細胞の正常なミトコンドリアの局在および動きを変える方法を研究するためにイメージングプロトコルを使用しています。
我々の研究の過程で、解剖または他の細胞ストレッサーによって導入されたストレスがミトコンドリアの局在に大きな影響を与えることがわかった。一般的なストレスが、実験的治療とは対照的に、細胞内構造の局在または行動に何らかの変化の原因であるかどうかを特定するコントロールとしてである。過酸化水素を用いた制御ストレスを導入するこのプロトコルを開発しました。
このビデオでは、過酸化水素が酸化的損傷を誘導してミトコンドリアとリボヌクレオプロテインCluの分布をどのように変化させるかを示します。このライブイメージング技術に最も適したメディアには、15%の熱不活化ウシウシ血清、0.6 Xペンストレップ、およびマイクロリットル牛インスリンあたり200マイクログラムを含むシュナイダーのショウジョウバエ培地が含まれていました。滅菌条件下で媒体調製を行うことは、それが汚染されないことを保証する。
内容をよく混ぜて、一晩4度で保存します。インスリンは完全なシュナイダーのメディアに完全に溶解しないし、沈殿物がチューブの底に落ち着くのに気づくでしょう。それはイメージングを妨げるので、この沈殿物を残すことを確認して、アリコートを作ります。
この溶液は、4度でアリコートに格納されている場合、1ヶ月間使用することができる。最適な雌の生殖細胞のイメージのために、まずピーナッツバターの一貫性である湿った酵母ペーストのダブを含むバイアルを準備する。これにより、メスが十分に供給され、イメージング用のすべての卵胞発生段階が生成されます。
最適に健康なハエのために、ゼロから1日の古いメスを収集し、濡れた酵母ペーストを含むフライフードバイアルに男性と一緒に転送します。彼らはそれに固執することができるように眠っているハエが酵母ペーストに接触しないことを確認してください。ハエに3〜7日餌を与え、毎日酵母ペーストを交換します。
酵母ペーストがフライフードに接触することを確認してください。酸化的損傷を誘発するために、過酸化水素30%のストック溶液を使用し、ミトコンドリアを可視化し、100ミリモルTMREのストック溶液を使用します。過酸化水素は酸化の影響を受けやすく、TMREは時間の経過とともに分解されるため、培地溶液を新鮮に調製することが重要です。
解剖の直前に、完全なシュナイダーのメディアで、2つのマイクロモルモル過酸化水素、46ナノモルTMREの新鮮なアリコート、および46ナノモルTMREと2つのマイクロモル水素過酸化水素の新鮮なアリコートを準備します。卵巣解剖のためには、2組の細かい鉗子と電解的に研がれたタングステン針が必要です。卵巣を解剖するには、室温まで温められた完全なシュナイダーのメディアで時計ガラスを満たし、鉗子を使用してメディアに単一のフライを置きます。
細かい鉗子を1組使って胸郭でハエをそっとつかみます。他の鉗子で、後部をつかみ、穏やかに引っ張って卵巣を取り除きます。余分なキューティクルや組織を取り除き、新鮮な培地を含む新しい井戸に卵巣を移します。
卵巣はまだ周囲の筋肉鞘から移動する必要があります。鋭利なタングステン針を使用して、周囲の筋肉鞘を取り除くように注意して、卵胞を優しくいじめます。ここで示すように、筋鞘が取り除かれない場合、卵巣はぴくぴくし、画像取得に問題を引き起こす。
卵巣をきれいに解剖したら、内因的に標識された構造を視覚化する場合は、100マイクロリットルのメディアでMatTek皿に移します。TMREで標識されたミトコンドリアを視覚化する場合は、TMRE培地の100マイクロリットルの低下物で卵巣をMatTek皿に移します。卵巣は液滴の底に沈みます。
できるだけ早く組織のイメージングを開始するためには、切り分けの練習が重要です。卵胞を取り付けたら、逆顕微鏡に皿を置き、前処理条件の記録として静止画または短いビデオを取得します。これが完了したら、ライブイメージングを一時停止し、蓋を取り外し、2つのマイクロモル酸化水素調製溶液の100マイクロモルリットルを慎重に追加します。
既存のメディアの液滴の表面を壊したり、溶液をあまりにも早く添加したりして、底部に置き換える卵巣を置き換えないようにしてください。皿カバーを交換し、目的の卵巣を再配置して再焦点を合わせ、イメージングを再開します。実験処理は時間に敏感であるため、できるだけ早くイメージングを再開するように注意してください。
ここに示されているのは、過酸化水素後の処理で撮影された映画の静止画です。ミトコンドリアおよび雌の生殖細胞は、ハエが十分に供給され、健康であるときに細胞質全体に分散される。過酸化水素添加後、酸化損傷によりミトコンドリアが凝集し、処理後10分程度で迅速に見ることができます。
20分後、ミトコンドリア膜電位が消散する原因となる。したがって、ミトコンドリアの大部分は消えていく。このプロセスのライブムービーでは、ミトコンドリアはすぐに束々と見ることができ、ミトコンドリアの大部分は最終的に消えていきます。
細胞質、特に周囲の卵胞細胞における脈動の点滅は、TMRE付加の特徴として現れる。前述のように、過酸化水素添加後迅速にイメージングを行う必要があります。ここに示すように、あまりにも多くの時間が経過すると、ミトコンドリア膜電位はすでに失われ、TMRE標識が消失し、データが解釈不能になる。
これらのビデオ静止画では、GFP内因に標識されたClu粒子は、十分に供給された女性の胚芽に強く豊富である。過酸化水素添加後、Clu粒子は10分以内に分散する。これは、付属のビデオで示されています。
過酸化水素添加後、Clu至福の粒子は素早く分散する。このプロトコルは、ショウジョウバエ雌胚芽細胞におけるミトコンドリアおよびClu至福粒子の野生型の局在化を正確にイメージングするための有用なツールであることを発見した。このプロトコルは、ライブイメージング研究の広い範囲に適用されるべきであり、同様に固定前に組織を治療するために使用することができる。
最も重要なステップは、筋肉鞘の無い卵巣体を単離し、過酸化水素を穏やかに添加し、卵巣を外さないように、そして過酸化水素添加後すぐに画像化することです。さまざまな細胞下構造を生画像化するための便利なコントロールを見つけることを願っています。あなたの実験を見て、幸運をありがとう。
