Наша лаборатория использует Drosophila melanogaster для выявления и характеристики генов и путей, которые регулируют митохондриальную функцию во время развития и физиологического гомеостаза. Протокол, представленный здесь, использует живую визуализацию с добавлением перекиси водорода для визуализации влияния окислительного повреждения на локализацию и динамику субклеточных структур во взрослом яичнике дрозофилы. Мы часто используем протоколы визуализации для изучения того, как мутации изменяют нормальную митохондриальную локализацию и движение в женских зародышевых клетках.
В ходе наших исследований мы обнаружили, что стресс, введенный в результате вскрытия или других клеточных стрессоров, оказал глубокое влияние на митохондриальную локализацию. Как контроль, чтобы определить, является ли общий стресс, в отличие от экспериментального лечения, является причиной каких-либо изменений в локализации или поведение подклеточных структур. Мы разработали этот протокол, чтобы ввести контрольный стресс с использованием перекиси водорода.
В этом видео мы продемонстрируем, как перекись водорода индуцированного окислительного повреждения изменения распределения митохондрий и рибонуклеопротеин Clu. Средства массовой информации лучше всего подходит для этой живой техники изображения, содержащие Drosophila сми Шнайдера, содержащие 15% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 0,6 X Pen-Strep, и 200 микрограммов на микролитер крупного рогатого скота инсулина, в дальнейшем называют полным Сми Шнайдера. Выполнение подготовки средств массовой информации в стерильных условиях гарантирует, что она не будет загрязнена.
Смешайте содержимое хорошо и хранить на ночь при четырех градусах. Инсулин не растворяется полностью в полных средствах массовой информации Шнайдера, и вы заметите осадок поселиться в нижней части трубки. Сделать aliquots, будучи уверенным, чтобы оставить этот осадок, как это будет мешать изображений.
Это решение может быть использовано в течение одного месяца, если хранится в aliquots при четырех градусах. Для оптимальной визуализации женских зародышевых клеток сначала подготовьте флакон, содержащий мазок влажной дрожжевой пасты, которая является консистенцией арахисового масла. Это гарантирует, что самки хорошо питаются и будет производить все стадии развития фолликула для визуализации.
Для оптимально здоровых мух, собирать от нуля до одного дня старых самок и передачи с самцами в муху пищевой флакон, содержащий влажную дрожжевую пасту. Убедитесь, что спящие мухи не контакт дрожжевой пасты, как они могут придерживаться его. Кормите мух три-семь дней, меняя дрожжевую пасту ежедневно.
Убедитесь, что дрожжевая паста контакты мухи пищи, чтобы она не высохла. Чтобы вызвать окислительный ущерб, мы будем использовать фондовый раствор 30%перекиси водорода и визуализировать митохондрии, мы будем использовать фондовый раствор 100 миллимоляр TMRE. Важно подготовить медиа-решения свежими, потому что перекись водорода подвержена окислению и TMRE ухудшается с течением времени.
Прямо перед вскрытием, в полных средствах массовой информации Шнайдера, подготовить свежий aliquot из двух микромоляных перекиси водорода, свежий aliquot 46 наномолярных TMRE, и свежий aliquot 46 наномолярных TMRE плюс два микромолара перекиси водорода. Для вскрытия яичников вам понадобится две пары тонких типсов и пара электролитически заточенных вольфрамовых игл. Чтобы вскрыть яичники заполнить часы стекла с полным средством Шнайдера, который был разогрет до комнатной температуры, а затем поместить одну муху в средствах массовой информации с помощью типсов.
Аккуратно схватите муху за грудную клетку, используя одну пару тонких типсов. С другими типсами, схватить задний и осторожно тянуть, чтобы удалить яичники. Удалите посторонние кутикулы или ткани, а затем передать яичник в новый колодец, содержащий свежие средства массовой информации.
Яичники должны по-прежнему движется от окружающих мышечной оболочки. Используя заточенные иглы вольфрама, осторожно дразнить друг от друга яичников, заботясь, чтобы удалить окружающие оболочки мышц. Если мышечная оболочка не будет удалена, как попродемонстрировано здесь, яичники будут дергаться, вызывая проблемы с получением изображения.
После того, как ovarioles были чисто расчленены, передать их в 100 микролитров капли средств массовой информации в блюдо MatTek при визуализации эндогенно помечены структур. Передача ovarioles в 100 микролитров капли TMRE средств массовой информации на блюдо MatTek при визуализации митохондрий помечены TMRE. Яичники окаймятся на дно капли.
Важно практиковать вскрытия для того, чтобы начать визуализацию ткани как можно быстрее. После того, как ovarioles установлены, поместите блюдо на перевернутый микроскоп и приобрести еще изображения или краткие видео, как запись предварительных условий выполнения. Как только это будет сделано, приостановить живую визуализацию, удалить крышку, и тщательно добавить 100 микролитров двух микромоляных перекиси водорода подготовлен раствор.
Избегайте разрушения поверхности существующей капли мультимедиа или добавления раствора слишком быстро, чтобы не вытеснять яичники, лежащие на дне. Замените крышку блюда, переместим и переориентуут желаемую яичнику и возобновите визуализацию. Позаботьтесь о том, чтобы возобновить визуализацию как можно быстрее, так как экспериментальное лечение является чувствительным к времени.
Здесь по-прежнему показаны изображения из фильма, сделанные после лечения перекиси водорода. Митохондрии и женские зародышевые клетки рассредоточены по всей цитоплазме, когда мухи хорошо питаются и здоровы. После добавления перекиси водорода, окислительное повреждение вызывает митохондрии к слипанию, которое можно увидеть так быстро, как 10 минут после лечения.
Через 20 минут повреждение приводит к рассеиванию митохондриальной мембраны. Таким образом, большинство митохондрий исчезают. В этом живом фильме этого процесса, митохондрии можно увидеть быстро слипания и большинство митохондрий в конечном итоге исчезают.
Пульсирующее мигание в цитоплазме, особенно в окружающих клетках фолликула, кажется характерным для добавления TMRE. Как упоминалось ранее, визуализация должна происходить быстро после добавления перекиси водорода. Как показано здесь, если слишком много времени проходит, митохондриальный мембранный потенциал уже потерян и маркировка TMRE рассеивается, делая данные неимовежимыми.
В этих видео-прежнему изображения, GFP эндогенно помечены Clu частицы являются надежными и обильные в зародышевой плазме хорошо кормили женщин. После добавления перекиси водорода частицы Clu рассеиваются в течение 10 минут. Об этом свидетельствует сопроводительное видео.
После добавления перекиси водорода частицы блаженства Clu быстро рассеиваются. Мы обнаружили, что этот протокол является полезным инструментом для обеспечения точной визуализации дикого типа локализации митохондрий и частиц блаженства Clu в женских зародышевых клетках Drosophila. Этот протокол должен быть применим для широкого спектра живых исследований изображений и может быть использован для лечения тканей до фиксации, а также.
Наиболее важными шагами являются изолировать яичники, свободные от мышечной оболочки, аккуратно добавить перекись водорода, чтобы не выбить яичники, и изображение быстро после добавления перекиси водорода. Мы надеемся, что вы найдете это полезный контроль для живой визуализации различных подклеточных структур. Спасибо за просмотр и удачу в ваших экспериментах.
